Причины агглютинации эритроцитов, ее виды и антиглобулиновый тест

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

Введение

Гелевая технология в микропробирках (ГТМ) была предложена Y. Lapierre в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле “сефадекс”, помещенном в микропробирки. Обычно система представляет собой пластиковые карты, содержащие микропробирки, заполненные гелем (патент DiaMed AG, Швейцария). Иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидкофазных системах.

Одним из наиболее важных условий получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабофиксированных антител в процессе отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста.

Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата.

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Принцип гелевого теста

Забуференный декстрановый гель Sephadex ТМ G 100 superline может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками – в отличие от стандартных серологических методик – с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме. Если условия центрифугирования не выполняются (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое) могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий (форсировании) центрифугирования. Использование автоматической ID-центрифуги (ДиаМед) устраняет эти проблемы. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

1. нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым, и ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
2. специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл и т.д.)
3. антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста (реакции Кумбса) при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером частиц геля и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета – отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще – положительный результат.

Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

• сильноположительный (++++) – образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
• положительный (+++) – агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
• слабоположительный (++) – агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
• очень слабоположительный (+) – агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
• отрицательный (-) – эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

Оборудование и реактивы

• ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;
• ID-центрифуга для центрифугирования карт;
• термостат на +37°С;
• штатив для пробирок и карт;
• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;
• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);
• перчатки резиновые хирургические;
• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);
• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы – LISS, РНИС);
• 0,9% раствор хлорида натрия;
• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Характеристика идентификационных карт

Идентификационные карты (ID-карты) Диа-Мед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (сtl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-СDЕ-сtl или С-с-Е-е-К-ctl. Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты “Coombs / Enzyme Test”: в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические – к иммуноглобулинам различных классов) – реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.

Общие правила использования идентификационных карт

1. Идентификационные карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-25°С. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках.
2. Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8°С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.
3. Во избежание получения ложных результатов исследований, запрещается использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа или при повреждении оболочки.
4. Заготовка крови осуществляется с применением современных флеботомических методик, а также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.

Типирование антигенов эритроцитов

ID-карты ДиаМед предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты ДиаМед можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DСЕ, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер.

• Алгоритм проведения исследований [показать] .
• Дальнейшие действия [показать] .

Используемые ID-карты

При определении групп крови и резус-принадлежности применяют поликлональные (табл. 18.10 [показать] ) и моноклональные (табл. 18.11 [показать] ) реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.

По современной классификации лица с ослабленным вариантом антигена D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z антигена D. Лица категории VI (резус-отрицательные реципиенты, но резус-положительные доноры!) могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Для подтверждения группы крови используют различные ID-карты: D(IV – ) – для реципиентов, D(IV + ) – для доноров.

Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция) (табл. 18.12 [показать] ).

Для углубленного обследования используют другие карты (табл. 18.13-18.14 [показать] ).

Выявление антиэритроцитарных антител

Принцип метода

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активность и оценивается от ++++ до +.

• Алгоритм проведения исследований [показать] .
• Интерпретация результатов [показать] .

Скрининг и идентификация антител

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент (табл. 18.15-18.16 [показать] ). В первом случае для исследования используются обработанные ферментом эритроциты, во втором – суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

Методы исследования антител к антигенам эритроцитов

• Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса) [показать] .
• Ферментный метод [показать] .
• Метод холодовой агглютинации [показать] .

Определение совместимости крови донора и реципиента

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора – наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа. Проведение такой пробы позволяет:

1. подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;
2. выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов(табл.18.17 [показать] ) не заменяет обязательное имуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.

Ввиду того, что сенсибилизация может появиться даже после трансфузий индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо использовать каждый раз свежую сыворотку пациента, полученную после последней трансфузии гемокомпонентов.

Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора!

• Ход определения [показать]
• Результаты пробы на совместимость (4, 5 микропробирки) [показать]
• Ограничения [показать]
• Условия хранения и эксплуатации [показать]

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.

Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для учебных целей в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод.

Гелевый тест выполняется и оценивается по выше приведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого атиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные результаты.

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, 2001

Антиглобулиновый тест. Прямая и непрямая реакция Кумбса.

• УЗИ
• Функциональная диагностика
• Рентген методы
• Эндоскопические методы

1. Что такое антиглобулиновый тест, или реакция Кумбса?

Антиглобулиновый тест, или реакция Кумбса проводится для того, чтобы выявить определенные антитела, которые атакуют красные кровяные клетки (эритроциты).

Антитела это белки, производимые иммунной системой. Как правило, антитела связываются с посторонними веществами, такими как бактерии и вирусы, и уничтожают их.

2. Зачем нужен тест на антитела?

Тест на антитела может проводиться в следующих случаях:

Перед переливанием крови

Вы наверняка знаете, что у человека может быть одна из четырех групп крови. И антиглобулиновый тест можно проводить для определения возможности переливания крови. Если вам делают переливание, кровь донора должна соответствовать вашему типу (иметь одинаковые антигены). Если при переливании антигены отличаются, иммунная система разрушит перелитые клетки. Это может привести к серьезным заболеваниям и даже смерти. Именно поэтому поиск нужного типа крови является столь важным фактором.

Для выявления риска резус-сенсибилизации

Резус это антиген. Его полное название – резус-фактор. Тест Кумбса используется для обнаружения антител к резус-фактору в крови у беременных женщин. Если женщина с отрицательным резус-фактором крови беременна ребенком с положительным резус-фактором (он может передаваться от отца), есть риск наступления резус-сенсибилизации. Резус- сенсибилизация происходит, когда кровь ребенка смешивается с кровью матери во время беременности или родов. Если группа крови матери несовместима с группой крови ребенка, то ее иммунная система может атаковать плод, воспринимая его чужеродным объектом. При этом может развиться тяжелое заболевание, именуемое эритробластозой плода. В редких случаях, если заболевание не лечить, плод или новорожденный могут погибнуть.

Женщине с отрицательным резус-фактором крови могут провести инъекцию анти-Rh- гаммаглобулина (например, RhoGAM), используемого для предотвращения развития Rh- гемолитической болезни.

Для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии

Аутоиммунная гемолитическая анемия является редким заболеванием, связанным с образованием антител к собственным антигенам эритроцитов.

3. Типы антиглобулиновой пробы

Существуют два типа антиглобулиновой пробы, или реакции Кумбса: прямой и непрямой.

Прямая реакция Кумбса, или прямой антиглобулиновый тест обнаруживает антитела, связанные с эритроцитами. Он используется для определения анемии. При этой болезни эритроциты разрушаются быстрее, чем производятся.

Непрямая реакция Кумбса, или непрямой антиглобулиновый тест проводится для поиска антител, не связанных с эритроцитами. Для пробы используется сыворотка крови, в которой и находятся антитела. Эта процедура достаточно редкая: в основном ее проводят для определения возможности переливания крови или как этап обследования беременных женщин.

4. Результаты реакции Кумбса

Отрицательный результат теста – антитела не обнаружены.

• Прямой тест Кумбса. Отрицательный результат прямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь не имеет антител, связанных с эритроцитами.
• Непрямой тест Кумбса. Отрицательный результат непрямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь совместима с кровью донора. Для беременной женщины такой результат означает, что ее организм не выработал антитела против резус- положительного типа крови своего ребенка (резус-сенсибилизации не произошло).

Отклонение от нормы:

• Прямой тест Кумбса. Положительный результат прямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь имеет антитела, которые борются против эритроцитов. Это может быть вызвано переливанием несовместимой крови или такими заболеваниями, как гемолитическая анемия или гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН).
• Непрямой тест Кумбса. Положительный результат непрямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь несовместима с кровью донора. У беременной женщины такие результаты означают присутствие антител против положительного резус-фактора крови ребенка (резус-сенсибилизация). Если ребенок имеет положительный резус-фактор крови, мать будет внимательно наблюдаться врачом на протяжении всей беременности.

Причины агглютинации эритроцитов, ее виды и антиглобулиновый тест

Скрининговое лабораторное исследование, позволяющее выявить фиксированные на эритроцитах аутоантитела разных классов, которые играют основную роль в разрушении клеток при гемолитических анемиях.

Прямой антиглобулиновый тест, ПАГТ, прямой тест Кумбса, прямая реакция Кумбса.

Direct antiglobulin test (DAT) with polyspecific antihuman globulin (AHG), Direct Coombs Test, Direct Anti-human Globulin Test.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Аутоиммунные гемолитические анемии характеризуются выработкой антител к эритроцитарным антигенам с последующим разрушением эритроцитов вследствие фагоцитоза или активации системы комплемента.

В зависимости от места, где происходит процесс разрушения эритроцитов, различают внутрисосудистый и внутриклеточный иммунный гемолиз. При внутрисосудистом гемолизе разрушение эритроцитов обусловлено прямым повреждающим действием антител при участии системы комплемента. Комплемент – это семейство сывороточных белков, которые разрушают меченные антителами клетки. Эффекторами внутрисосудистого гемолиза чаще всего являются аутоантитела класса IgM, реже IgG. Антитела фиксируют комплемент на мембране эритроцита с образованием мембраноповреждающего комплекса, формирование которого приводит к образованию большого количества пор в оболочке клетки, ее набуханию и разрушению. Антитела, вызывающие внутрисосудистый гемолиз, называют холодовыми, поскольку они наиболее эффективно связываются с антигенами эритроцитов при температуре 4-18 °С. В процессе внутриклеточного гемолиза участвуют макрофаги – специальные клетки, основная функция которых – поглощение и разрушение чужеродных и меченных антителами субстанций. Макрофаги имеют рецепторы к IgG и С3 компоненту комплемента, поэтому покрытые ими эритроциты захватываются макрофагами и разрушаются. Антитела, вызывающие внутриклеточный гемолиз, называют тепловыми, так как они наиболее эффективно связываются с антигенами эритроцитов при 37 °С.

Таким образом, в качестве лабораторных маркеров аутоиммунного гемолиза целесообразно использовать выявление фиксированных на эритроцитах антител классов IgM и IgG, а также С3 компонента комплемента. В зависимости от эффекта, который аутоантитела оказывают на эритроциты в пробирке, выделяют гемолизины (разрушают клетки) и агглютинины (вызывают склеивание эритроцитов между собой). На способности аутоантител in vitro, то есть в пробирке, вызывать агглютинацию эритроцитов и построено большинство лабораторных методик их выявления.

Современным методом постановки прямого антиглобулинового теста является реакция агглютинации в геле. Используемый в реакции полиспецифический антиглобулиновый реагент содержит антитела к иммуноглобулинy G и к С3 компоненту системы комплемента человека, а также может реагировать с IgA и IgM молекулами. В микропробирки с гелем, содержащим антиглобулиновый реагент, добавляют суспензию исследуемых эритроцитов и центрифугируют. При наличии на поверхности эритроцитов аутоантител они связываются с реагентом, что приводит к агглютинации эритроцитов между собой. В процессе центрифугирования происходит разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов. Неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером частиц геля, и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета, а агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще.

Для чего используется исследование?

• Для обнаружения антител к антигенам собственных эритроцитов, фиксированных на их поверхности.

Когда назначается исследование?

• При выяснении причин гемолитической анемии (когда есть подозрение, что гемолиз обусловлен наличием аутоантител).

Что означают результаты?

Антиэритроцитарные антитела к IgG и C3d-компоненту комплемента не обнаружены.

Норма – клетки образуют компактный осадок на дне микропробирки.

Агглютинированные клетки образуют красный слой на поверхности или в толще геля.

• Положительный тест с полиспецифическим антиглобулиновым реагентом показывает, что эритроциты в живом организме покрыты антителами или комплементом. Для дифференциации класса иммуноглобулинов и компонентов комплемента необходимо использовать моноспецифические реагенты: анти-IgG, анти-IgA, анти-IgM, анти-C3, анти-C3b, анти-C3c, анти-C3d и анти-С4.
• Важно отметить, что описанный лабораторный метод позволяет выявить только те аутоантитела, которые фиксированы на эритроцитах. Вместе с тем антитела могут находиться в сыворотке крови – для их выявления применяют непрямой антиглобулиновый тест. При этом исследуют не эритроциты, а сыворотку пациента. Для этого ее инкубируют с донорскими эритроцитами, на которых при наличии в исследуемой сыворотке антител в процессе инкубации фиксируются иммуноглобулины. Далее эти эритроциты исследуются по тому же принципу, что и прямой тест.

Клинический (общий) анализ крови

Билирубин (общий, прямой, непрямой)

Кто назначает исследование?

Гематолог, трансфузиолог, терапевт, врач общей практики, ревматолог, педиатр.

• Гематология: национальное руководство / под ред. О. А. Рукавицына. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. С. 155-157.

Williams Hematology. 9th edition. By: Kenneth Kaushansky, Marshall Lichtman, Josef Prchal, Marcel M. Levi, Oliver Press, Linda Burns, Michael Caligiuri. McGraw-Hill Education, 2016. Pages 832-836.

Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23e by Richard A. McPherson MD MSc (Author), Matthew R. Pincus MD PhD (Author). St. Louis, Missouri : Elsevier, 2016. Pages 716–719.

Иммунологические методы исследования в лабораторной практике

Преимущества иммунологического метода исследования.

Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например lgA-антитела и lgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность иммунулогических методов превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах.

С помощью предложенного способа определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧ-инфекция). При трансплантации тканей и органов, иммунологический метод позволяет определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакцию Кастеллани для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе исследования изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

Развитию иммунологических методов способствовало создание моноклональных антител, продуцируемых гибридомой, полученной в результате слияния иммунокомпетентной клетки В-лимфоцита и клетки миеломы мышей. Моноклональные антитела несут только одну химически однородную популяцию антител, комплементарную специфической детерминанте антигена, что позволяет осуществлять тонкую дифференциацию белков. Развитие иммунологического метода исследования идет как по линии совершенствования реагентов (чистоты антигенов и антител), так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета.

Виды реакций метода иммунологического исследования.

В зависимости от их механизма и учета результатов, иммунологический метод исследования можно подразделить на 5 видов реакции.

1.Реакции, основанные на феномене агглютинации.

Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t 37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов. Антитела против резус-фактора являются неполными, они не способны к прямой реакции с резус-положительными эритроцитами, поэтому для их обнаружения используют реакцию Кумбса, основанную на выявлении неполных антител с помощью антиглобулиновых сывороток. К эритроцитам известной специфичности добавляют исследуемую сыворотку крови, а вслед за этим антиглобулиновую сыворотку против lgG (непрямая реакция Кумбса). Fab-фрагменты неполных антител исследуемой сыворотки крови присоединяются к эритроцитам, а к свободным Fc-фрагментам этих антител присоединяются антитела против lgG, и происходит агглютинация эритроцитов.

Реакция пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможения) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами, например, для серодиагностики клещевого энцефалита, в лунки панели разливают двукратные разведения сыворотки больного на щелочном боратном буферном растворе. Затем добавляют определенное количество, обычно 8 АЕ (агглютинирующих единиц), антигена клещевого энцефалита и после 18 ч экспозиции при t 4° вносят взвесь гусиных эритроцитов, приготовленную на кислом фосфатно-буферном растворе. Если в сыворотке крови больного есть антитела к вирусу клещевого энцефалита, то антиген нейтрализуется и агглютинация эритроцитов не происходит.

2.Реакции, основанные на феномене преципитации.

Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии, в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5–3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены, а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат.

При радиальной иммунодиффузии (по методу Манчини), иммунную сыворотку вносят в агар. Антиген, помещенный в лунки, диффундирует через агар, и в результате преципитации с иммунной сывороткой, вокруг лунок образуются непрозрачные кольца, внешний диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод используют для определения классов иммуноглобулинов, а модификации метода можно применять для определения противомикробных антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов.

Иммуноэлектрофорез основан на усилении миграции в геле антигенов и антител путем помещения пластины геля с реагентами в электрическое поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом.

Разновидностью иммуноэлектрофореза является радиоиммунофорез. В этом случае после электрофоретического разделения антигенов в канавку, вырезанную параллельно движению антигенов в геле, наливают сначала меченную радиоактивным йодом иммунную сыворотку против определяемых антигенов, а затем иммунную сыворотку против lgG-антител, которая преципитирует образовавшиеся комплексы антитела с антигеном. Все несвязавшиеся реагенты вымывают, а комплекс антиген-антитело обнаруживает методом авторадиографии.

3.Реакции с участием комплемента.

В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки, основанную на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам.

Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов, гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций.

Реакция радиального гемолиза эритроцитов может протекать в геле. Взвесь эритроцитов барана помещают в агарозный гель с комплементом; в застывшем на стекле слое делают лунки и вносят в них гемолитическую сыворотку. Вокруг лунок в результате радиальной диффузии антител образуется зона гемолиза, радиус которой прямо пропорционален титру сыворотки. Если сорбировать на эритроцитах какой-либо антиген, например гликопротеиновый гемагглютинин вируса гриппа, краснухи или клещевого энцефалита, то можно воспроизвести феномен гемолиза иммунными сыворотками к этим вирусам. Реакцию радиального гемолиза в геле применяют в диагностике вирусных инфекций. Она характеризуется простотой постановки, нечувствительностью к сывороточным ингибиторам, позволяет титровать сыворотки крови по диаметру зоны гемолиза, не прибегая к серийным разведениям.

Иммунное прилипание. Эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови имеют на поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ). Если к антигену (бактериям, вирусам и др.) добавить соответствующую иммунную сыворотку и комплемент, то образуется комплекс антиген-антитело, покрытый СЗ-компонентом комплемента. Эту реакцию применяют при изучении ряда вирусных инфекций (клещевого энцефалита, денге), которые сопровождаются иммунопатологическими процессами и циркуляцией в крови вирусных антигенов в комплексе с антителами.

4.Реакция нейтрализации.

Основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры, патогенность вирусов нейтрализуется и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.

5.Реакции с использованием химических и физических меток (ИФА).

Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченых флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченое флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген-антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства, отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате, в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против lgG-антител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегалии, лихорадки Ласса. Препараты с наслоенной исследуемой сывороткой крови помещают в термостат при t 37° для образования иммунных комплексов, а затем, после отмывания несвязавшихся реагентов, выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Применяя меченые иммунные сыворотки против lgM- или lgG-антител, можно дифференцировать тип антител и обнаруживать ранний иммунный ответ по наличию lgM-антител.

Иммунофлюоресценцию широко используют не только в бактериологии, вирусологии, паразитологии, но и в иммунопатологии для обнаружения антител к тканевым антигенам человека.

Иммуноферментные или энзим-иммунологические методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченых антител с антигеном, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к lgG ферментом, с окрашиванием в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение. Подобно иммунофлюоресценции, иммуноферментный метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.

Наиболее популярной разновидностью иммуноферментного метода является иммуносорбция. На твердом носителе, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченую ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов, на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченой ферментом антимикробной сывороткой. Повышению чувствительности иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина.

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченый радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению кривых связанной и несвязанной радиоактивной метки. Эта разновидность метода носит название конкурентной реакции. Существуют и другие модификации радиоиммунологического метода.

Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными конъюгатами с пероксидазой. Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания. Иногда используют автоматическую регистрацию с помощью спектрофотометра.

Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов:

• разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;
• переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот), путем наложения пластины полиакриламидного геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозу (электроблоттинг);
• выявления на подложке искомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции.

Как диагностический метод, иммуноблоттинг используют при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса.

Научные статьи

«Некоторые особенности выявления неспецифической агглютинации при типировании крови по системе АВ0», 2007г., Е.П. Понамарева, Н.М. Портнова

МОДЕРНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОВРЕМЕННЫЕ ВОПРОСЫ ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ:

материалы 42-й научно- практической межрегиональной конференции врачей

Ульяновской области. 2007год.

Е.П. Понамарева, Н.М. Портнова

«НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ТИПИРОВАНИИ КРОВИ ПО СИСТЕМЕ АВО»

Учение о группах крови легло в основу научной и практической раз­работки метода переливания крови, позволив объяснить явления совмести­мости или несовместимости крови донора и реципиента. Групповая система АВО явилась первой открытой изосерологической системой крови человека, кроме которой есть много групповых систем, имеющих значение в клини­ческой практике. Под групповыми (изосерологическими) системами крови человека подразумевается определенные сочетания отдельных антигенных свойств эритроцитов (групповых факторов) и антител по отношению к ним, находящимся в плазме крови. Наличие антигенов и их сочетаний являются постоянной характеристикой крови человека, в то время как наличие анти­тел в норме, характерно только для некоторых систем, главным образом для групповой системы АВО.

Правильность определения групповой принадлежности крови донора и реципиента имеет большое значение в предотвращении посттрансфузион-ного осложнения гемолитического типа. Ошибки в типировании антигенов эритроцитов системы АВО могут быть обусловлены как техническими по­грешностями, так и индивидуальными особенностями исследуемой крови и недостаточно высоким качеством применяемых реактивов. Во избежания ошибок считается обязательное определение группы крови как донора, так и реципиента в лабораториях проводить перекрестным способом с исполь­зованием стандартных эритроцитов 0(I), А(II), B(III) и стандартных изоге-магглютинирующих сывороток или цоликлонов, с учетом специфических агглютинации (реакции склеивания эритроцитов).

При исследовании групповой принадлежности крови по системе АВО у доноров и больных могут наблюдаться отклонения от обычной картины агглютинации. Это выражается в отсутствии специфической или наличии неспецифической агглютинации, а также несовпадения результатов иссле­дования по стандартным сывороткам и стандартным эритроцитам. Чаще всего затруднения связаны с присутствием в исследуемой крови аутоантител или аллоантител в сыворотке и искажают результаты АВО – типирования. Дополнительное исследование сывороток с произвольно взятыми образцами эритроцитов может показать какими антителами обусловлена агглютинация – специфическими или неспецифическими. Неспецифиче­ская холодовая агглютинация проявляется в том, что антитела агглютинируют любые образцы эритроцитов, независимо от типа антигенов. По законам изоагглютиннации сыворотка никогда не содержит изоагглютининов, спо­собных реагировать с эритроцитами той же самой крови. Однако клиниче­ские и экспериментальные наблюдения показывают, что аутоагглютинация иногда встречается, как патологическое явление при некоторых заболева­ниях человека: при сердечно – сосудистых заболеваниях, онкологических, гематологических, заболеваниях печени, туберкулезе, сифилисе, малярии, ожоговой болезни и т. д.

Аутогглютинация заключается в том, что эритроциты склеиваются в «кучки» не в самом организме, а по извлечению крови и охлаждении ее до температуры окружающей среды, без прибавления к ней каких-либо сы­вороток или реактивов и идентична со складыванием эритроцитов в «мо­нетные столбики». Наклонность эритроцитов к образованию «монетных столбиков» существует вообще во всякой крови и усиливается при пато­логических условиях, так что «столбики» могут быстро превращаться в не­правильные массы, однако это не есть истинная агглютинация. По существу аутоагглютинация и образование «монетных столбиков» (гемоимпиляция) одно и то же и различаются между собой только интенсивностью, а с кровя­ными группами ничего общего не имеют. Известно также, что в нормальной крови гемоимпиляция может отмечаться такой интенсивностью, что симу­лирует изоагглютинацию (так называемая псевдоагглютинация). В практи­ке наблюдается еще разновидность неспецифической агглютинации, когда сыворотка склеивает любые эритроциты: при понижении температуры до 8-100 С (холодовые агглютинины) и при комнатной температуре, исчезает склеивание при повышении температуре до 22-250 С. Все эти явления не имеют отношения к истинной агглютинации и носят общее название «панагглютинация», что может быть одним из источников ошибок при опреде­лении группы крови по системе АВО.

Неспецифические холодовые антитела мало опасны для донора и больного. Однако они могут блокировать т. е. маскировать одновременно присутствующие в сыворотке крови специфические антитела, имеющие значение при подборе крови для трансфузии.

В практической деятельности группы апробации крови областной станции переливания крови отмечается тенденция роста выявления неспе­цифических гемагглютинаций (НГА) при типировании доноров по системе АВО. За последние годы, в диапазоне от 35000 до 40000 исследований в год, выявлены следующие цифры неспецифических гемагглютинаций: 1996 год 334, 1997 год – 558,1998 год – 810,1999 год – 1742, 2000 год – 1291,2001 год 1407, 2002 год – 1116, 2003 год – 1090, 2004 год – 1246, 2005 год – 1335, 2006 год – 1494.

Имеют место факты повторяющихся НГА у доноров, впоследствии у которых обнаруживается инфекционное заболевание. НГА совпадают с пе­рестановкой крови доноров на маркеры гепатитов, сифилиса, ВИЧ-инфек­ции. Так в 2005 году 49 совпадений перестановки результатов исследований

– подтверждено 18 инфекционных заболеваний, в 2006 году из 32 совпаде­ний – подтверждено 5 инфекционных заболеваний. Это свидетельствует о том, что доноры (практически – здоровые люди) попадают на кроводачу в серонегативном периоде инфекционного заболевания или уже болея, но еще не зная об этом. В беседах с донорами выясняются и другие факторы влия­ющие на появление у них НГА: экологическая обстановка региона, социаль­ные условия труда и быта и патологические состояния организма.

Правильность типирования доноров и реципиентов по системе АВО имеет большое значение в профилактике посттрансфузионных осложнений гемолитического и негемолитического типа, на станции переливания крови проводятся дополнительные исследования антигенов эритроцитов и сыво­роточных белков крови человека. Так как при наличии неспецифических гемагглютининов, плазма в лечебную сеть не выдается, а направляется на фракционирование с целью получения белковых препаратов.

Проводимая работа выполняется для улучшения качества выпускае­мой продукции.

Проба Кумбса непрямая

Аллоиммунные антиэритроцитарные антитела

Синонимы русские

Аллоиммунные антиэритроцитарные антитела, Непрямая реакция Кумбса, Проба Кумбса косвенная, Непрямой антиглобулиновый тест, НАТ, Титр антирезусных антител, Реакция агглютинации для определения титра антирезусных антител

Синонимы английские

RBC Antibody Screen, Indirect Antiglobulin Test, IAT, Indirect Coombs Test, Indirect Anti-human Globulin Test, Antibody Screen, Anti Rh, Rh Typing.

Зачем нужно исследование?

Для выявления антител, направленных против антигенов эритроцитов

Антитела – белок, вырабатываемый лимфоидной тканью в ответ на присутствие антигена.

Аантиген – вещество, которое вызывает выработку антитела, которое связывается с антигеном, чтобы повредить, нейтрализовать или уничтожить его. Наличие определенных антигенов в клетках крови является основой для типирования крови при переливании крови.

В каких случаях назначается?

• При подготовке к переливанию крови.
• во время беременности и при родах.

Какой биоматериал используется для исследования?

Как подготовиться к исследованию?

Особой подготовки не требуется.

• Исключить алкоголь за сутки до исследования.
• Не принимать пищу в течение 12 часов перед исследованием, можно пить чистую негазированную воду.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение за 30 минут до исследования.
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Что исследуется?

Титр антирезусных антител ищет циркулирующие антитела в крови, направленные против эритроцитов. Основная причина, по которой у человека могут циркулировать антитела к эритроцитам в крови, заключается в том, что он получил при переливании крови или во время беременности другие эритроциты, отличные от его (чужеродные эритроциты). Эти антитела могут нанести вред, если человеку попадут эритроциты, на которые могут нацеливаться антитела, или если у беременной женщины есть антитела, нацеленные на эритроциты ее развивающегося плода.

Эритроциты обычно имеют структуры на поверхности, называемые антигенами. У людей есть свой индивидуальный набор антигенов на их эритроцитах, определяемый наследованием от их родителей. Основными антигенами или поверхностными идентификаторами на эритроцитах человека являются антигены O, A и B, а кровь человека группируется в группу крови A, B, AB или O в зависимости от наличия или отсутствия этих антигенов.

Другим важным поверхностным антигеном является резус-фактор, также называемый D-антигеном. Если он присутствует в эритроцитах человека, его группа крови Rh + (положительная); если оно отсутствует, кровь имеет тип Rh- (отрицательный). Кроме того, существует много других типов антигенов эритроцитов, которые составляют менее известные группы крови, такие как Kell, Lewis, and Kidd группы крови.

Есть несколько причин, почему кто-то может производить антитела против антигенов эритроцитов:

После переливания крови: мы производим антитела, направленные против антигенов эритроцитов A и B, не подвергаясь воздействию антигенов. Перед переливанием крови группу АВО и резус-фактор человека сравнивают с донорской кровью, чтобы предотвратить возникновение серьезной реакции при переливания крови. То есть кровь донора должна быть совместима с кровью реципиента, чтобы антитела не реагировали и не разрушали клетки донорской крови.

Если кому-то переливают кровь, его организм может распознать другие антигены эритроцитов из других групп крови (например, Kell или Kidd), которые для донора не являются чужеродными. Реципиент (получатель) может производить антитела для атаки эти чужеродные антигены. Люди, у которых было несколько переливаний, вырабатывают антитела к эритроцитам, потому что они подвергаются воздействию чужеродных антигенов эритроцитов при каждом переливании.

1. Во время беременности при несовместимостью крови у матери и ребенка: ребенок может наследовать антигены от отца, которых нет в эритроцитах матери. Мать может подвергаться воздействию во время беременности или при родах чужеродных антигенов в эритроцитах ее ребенка, когда некоторые клетки ребенка попадают в кровообращение матери по мере отделения плаценты. Мать может начать вырабатывать антитела против этих чужеродных эритроцитарных антигенов. Это может вызвать гемолитическую болезнь новорожденного, обычно не затрагивая первого ребенка, но затрагивая последующих детей, когда антитела матери проникают через плаценту, прикрепляются к эритроцитам ребенка и гемолизируют их. Скрининг антител к эритроцитам может помочь определить, продуцировала ли мать антитела к эритроцитам вне группы крови АВО.

В первый раз, когда человек подвергается воздействию чужеродного антигена антирезусных антител при переливании крови или беременности, он может начать вырабатывать антитела, но его клетки обычно не имеют времени во время первого воздействия, чтобы произвести достаточное количество антител для фактического уничтожения чужеродных эритроцитов. Когда происходит следующее переливание или беременность, иммунный ответ может быть достаточно сильным для того, чтобы достаточное количество антител было выработано, прикреплено и разделено (гемолизировано) на перелитые эритроциты или эритроциты ребенка. Антитела к антигенам АВО встречаются в природе, поэтому не требуют воздействия чужеродных эритроцитов.

Антитела к эритроциту, которые обнаруживаются с помощью скрининга, могут быть идентифицированы с помощью теста идентификации антител (Alloantibody Identification, Antibody ID, RBC, RBC Ab ID).

Кто назначает исследование?

Гематолог, трансфузиолог, терапевт, врач общей практики, ревматолог, педиатр.

Общие вопросы

Для чего используется исследование?

Скрининг антител к эритроцитам используется для скрининга крови человека на наличие антител, направленных против антигенов эритроцитов антирезусных антител, отличных от антигенов A и B. Это выполняется всякий раз, когда ожидается переливание крови, или при пренатальном тестировании беременных женщин.

Основная причина, по которой у человека могут циркулировать антитела к эритроцитам в крови, заключается в том, что он получил при переливании крови или во время беременности другие эритроциты, отличные от его (чужеродные эритроциты). Эти антитела могут нанести вред, если человеку попадут эритроциты, на которые могут нацеливаться антитела, или если у беременной женщины есть антитела, нацеленные на эритроциты ее развивающегося плода.

Если антитела обнаружены, то проводится идентификация антител, чтобы определить, какие антитела присутствуют. Выполняется скрининг антител к эритроцитам, если присутствуют клинически значимые антитела. В случае переливания крови необходимо принимать во внимание антитела к эритроцитам и подбирать донорскую кровь, которая не содержит антиген(ы), к которому человек выработал антитела.

Если у кого-то возникает реакция (немедленная или отсроченная) на переливание крови, врач назначит прямой антиглобулиновый тест (прямую пробу Кумбса), чтобы помочь выяснить причину реакции. (ПАГТ обнаруживает антитела, прикрепленные к эритроцитам). Если ПАГТ положительный будет проведено исследование антител к эритроцитам, чтобы определить, выработал ли пациент новые антитела.

Во время беременности непрямой антиглобулиновый тест используется для выявления антител в крови матери, которые могут проникать через плаценту и атаковать эритроциты ребенка, вызывая гемолитическую болезнь новорожденного. Наиболее серьезной причиной является антитела, вырабатываемые в ответ на антиген эритроцитов, называемый «антиген D» в системе группы крови резус (резус-фактор).

Человек считается резус-положительным, если D-антиген присутствует в эритроцитах, и резус-отрицательным, если отсутствует. Резус-отрицательная мать может выработать антитела, когда она подвергается воздействию клеток крови резус-положительного плода. Чтобы предотвратить это, у резус-отрицательной матери должен быть проведен непрямой антиглобулиновый тест в начале беременности, через 28 недель и перед родами. Если в течение 28 недель отсутствуют резус-антитела, женщине делают инъекцию резус-иммуноглобулина (RhIg), чтобы удалить резус-позитивные эритроциты плода, которые могут присутствовать в ее кровотоке, чтобы предотвратить выработку резус-антител матерью.

При рождении определяется резус-фактор ребенка. Если у ребенка резус-отрицательный результат, то матери не требуется повторная инъекция. Если у ребенка резус-положительный результат, а у матери отрицательный статус на антиген D, матери назначается дополнительный RhIG.

Этот тест также может быть использован для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии в сочетании с прямым антиглобулиновым тестом. Это состояние может быть вызвано тем, что человек производит антитела против своих собственных антигенов эритроцитов. Это может происходить при некоторых аутоиммунных заболеваниях (например волчанка); при таких заболеваниях, как лимфома или хронический лимфолейкоз; при таких инфекциях, как микоплазменная пневмония и мононуклеоз. Это может также произойти с некоторыми людьми при использовании определенных лекарств (например пенициллин).

Когда назначается исследование?

Непрямой антиглобулиновый тест проводят перед любым предполагаемым переливанием крови.

Непрямой антиглобулиновый тест назначают на ранних сроках беременности как часть обследования каждой женщины при беременности. У резус-отрицательных женщин это также делается через 28 недель и после родов, если у ребенка определен резус-положительный результат. У отрицательных беременных женщин с известными антителами исследование иногда назначается в качестве инструмента мониторинга, чтобы приблизительно отслеживать количество присутствующих антител.

Что означают результаты?

• Переливание: если непрямой антиглобулиновый тест положительный, то присутствуют одно или несколько антител к эритроцитам. Некоторые из этих антител будут более значительными, чем другие. Когда исследование используется для скрининга перед переливанием крови, положительный тест указывает на необходимость проведения теста на идентификацию антител. Как только антитело было идентифицировано, должна быть найдена донорская кровь, которая не содержит соответствующего антигена(ов), чтобы антитело не вступало в реакцию и не разрушало донорные антигены после переливания крови.
• Беременность: Если у резус-отрицательной матери непрямой антиглобулиновый тест отрицательный, то в течение 72 часов вводится резус-иммуноглобулин для предотвращения выработки антител. Если у нее положительный результат, то антитело или антитела должны быть идентифицированы. Если антитело к D-антигену активно формировалось матерью, то инъекция RhIg бесполезна. Если у нее другое антитело, тогда можно сделать инъекцию RhIg, чтобы она не продуцировала антитела к антигену D.

Дополнительная информация.

Циркулирующее антитело к эритроциту, когда оно присутствует, никогда не исчезнет, ​​но может упасть до неопределяемого уровня. Если человек снова подвергается воздействию антигена, произойдет быстрая выработка и атака эритроцитов, поэтому антитело будет воспринято (обработано, как если бы оно присутствовало), даже если оно не обнаружено.

Каждое переливание крови подвергает человека комбинации антигенов на эритроцитах донора. Всякий раз, когда перелитые эритроциты содержат антигены, чужеродные эритроцитарному количеству реципиента (получателя), существует возможность для образования антител. Если у кого-то происходит много переливаний крови в течение определенного периода времени, он может производить антитела против многих различных антигенов. Это может затруднить поиск совместимой крови.

Что было до разработки RhIg (резус-иммуноглобулина)?

До разработки инъекции резус-отрицательные матери часто становились сенсибилизированными (повышение чувствительности организма) из-за крови своего первого резус-положительного ребенка и начинали вырабатывать анти-резус-антитела. Любые последующие резус-позитивные дети будут иметь некоторую степень резус-заболевания из-за того, что анти-резус-антитела матери атакуют эритроциты ребенка. Выкидыш и мертворожденные дети были распространены, и те дети, которые родились, часто нуждались в немедленном переливании крови, чтобы выжить. Иммуноглобулин инъекция в значительной степени предотвращает эти осложнения, хотя у небольшой количества женщин все еще развивается резус-антитела.

Информация представлена в ознакомительных целях, не предназначена для самодиагностики и самолечения,
не может рассматриваться в качестве замены КОНСУЛЬТАЦИИ со СПЕЦИАЛИСТОМ .
Если у Вас наблюдаются схожие симптомы, советуем ЗАПИСАТЬСЯ НА ПРИЕМ к врачу в регистратуре.

Медицинские интернет-конференции

Языки

• Русский
• English
• КОНФЕРЕНЦИИ
• ЖУРНАЛ
• АВТОРАМ
• ОПЛАТА
• ЧаВО (FAQ)
• НОВОСТИ
• КОНТАКТЫ

Оптимизация условий прямой и обратной реакций агглютинации эритроцитов, усиленных стоячей ультразвуковой волной

• Фундаментальные дисциплины |
• Биофизика

Дубровский В.А., Медведева М.Ф.

Резюме

Ключевые слова

Введение

Автоматизация определения группы крови человека по системе ABO и Rh (системе резус) является актуальной задачей в связи большой частотностью этого вида лабораторного теста. Фирмами выпускаются различные модификации приборов такого рода, например (таблица 1):

В то же время существует немало теоретических и экспериментальных работ, направленных на усовершенствование имеющихся и разработку новых принципов конструирования подобных устройств, например, [1-9]. Одной из основных проблем, решаемых авторами, является повышение «разрешающей способности» (разрешение) разрабатываемого метода определения группы крови. Напомним, что под разрешающей способностью обычно понимают отношение измеряемого сигнала B+, соответствующего положительной реакции агглютинации (эритроцитарные агглютинаты образуются), к уровню сигнала B– для отрицательной реакции агглютинации (формирование агглютинатов отсутствует). Очевидно, что увеличение разрешающей способности K = B+/B– повышает надежность определения группы крови. Чрезвычайно важно отметить, что ошибка в определении группы крови образца должна исключаться абсолютно, единственное послабление прибору – в некоторых случаях он может не определить группу крови анализируемой пробы.

С целью повышения разрешения оптических методов регистрации реакции агглютинации эритроцитов в [10] было предложено использовать действие стоячей ультразвуковой (УЗ) волны на смесь «кровь-сыворотка». При облучении ультразвуком раствора смеси «кровь-сыворотка» в кювете образуется стоячая УЗ волна, которая приводила к группировке эритроцитов и их комплексов в области узлов. В результате раствор клеток крови расслаивался с пространственным периодом, равным половине ультразвуковой длины волны (λ/2). Сближение эритроцитов в узловых областях приводит к увеличению вероятности их взаимодействия, а следовательно, агглютинации при положительной реакции. При этом возрастают как скорость реакции агглютинации, так и размеры иммунных эритроцитарных комплексов и, как результат, скорость седиментации агглютинатов при выключении УЗ генератора (окончание эффекта левитации эритроцитов и агглютинатов). Оптически исследуемая среда становимтся более прозрачной.

При отрицательной реакции агглютинации эритроциты также группируются в узловых областях, формируются «неспецифические» аггрегаты, которые рассыпаются на отдельные эритроциты при выключении ультразвука. Естественно, скорость оседания «свободных» эритроцитов значительно ниже, чем агглютинатов, среда длительное время остается мутной. Различие в величине коэффициента пропускания исследуемых образцов для положительной и отрицательной реакций соответственно несет информацию о том, состоялась реакция агглютинации или нет, что используется для определения группы крови образца. По-видимому можно говорить о создании нового, акусто-оптического метода регистрации аглютинации эритроцитов, а, следовательно, определения группы крови. Этот метод основан на сочетании действия ультразвука на реакционную смесь «кровь-сыворотка» с оптическим ее зондированием. Детально механизм взаимодействия смеси «кровь-сыворотка» с ультразвуком рассмотрен в [11,12]. Регистрация укрупненных с помощью ультразвука агглютинатов методом проточной цитометрии осуществлена в [13,14], а с использованием явления седиментации в [15-17].

Следует отметить, что в работах [11-17] исследовалась агглютинация эритроцитов лишь на основе прямого метода – взаимодействие эритроцитов донорской крови со стандартной сывороткой. Известно, что в реальном типировании крови для обеспечения надежности используется «перекрестный» метод (кросс-метод), т.е. прямой метод анализа дополняется обратным – взаимодействие плазмы донорской крови со стандартными эритроцитами. Можно предположить, что применение обратного метода типирования крови потребует нахождения специфических по отношению к прямому оптимальных условий, при которых разрешающая способность акусто-оптического метода определения группы крови максимальна.

Задача настоящей работы – выявление оптимальных условий для агглютинации эритроцитов с целью повышения разрешения разрабатываемого акусто-оптического метода определения группы крови перекрестным образом.

Материал и методы

1. Общие сведения о биообъекте, пробоподготовке и технике экспериментов

В качестве объекта исследования выступала донорская кровь, стандартные агглютинирующие сыворотки и стандартные эритроциты. Независимо от вида перекрестного анализа типа крови, донорская кровь подвергалась центрифугированию и разделению на фракции: плазма и эритроцитарная масса. При проведении экспериментов прямой регистрации агглютинации эритроцитов приготавливалась трехкомпонентная смеси, состоящая из исследуемых эритроцитов, стандартной сыворотки и физиологического раствора. В случае обратной реакции агглютинации смесь включала в себя плазму того же образца крови, соответствующую порцию стандартных эритроцитов и физиологический раствор. При этом в обоих случаях с целью оптимизации соотношений компонент смеси их величины экспериментально варьировались.

Сразу после приготовления смеси каждая проба подвергалась воздействию стоячей ультразвуковой волны. Кювета с исследуемой смесью располагалась на пьезопреобразователе, волна ориентировалась в вертикальном направлении. Для возбуждения пьезокерамического преобразователя использовался генератор Г3-112/1 с усилителем, а его выходное напряжение контролировалось осциллографом С1-79. Генератор настраивался резонансно по отношению к преобразователю ν=2,25 МГц, а его выходное напряжение, подаваемое на пьезокерамику, не превышало 15 В, что обеспечивало ультразвуковое действие на эритроциты без их гемолиза. Время действия ультразвука, а также время последующей инкубации образца экспериментально варьировались.

Биообъект зондировался коллимированным излучением светодиода типа LXHL-G1S, спектр которого соответствовал спектру поглощения гемоглобина в зеленой области (рис1).

Из рис. 1 видно, что спектр излучения светодиода совпадает с одним из максимумов спектра поглощения гемоглобина в зеленой области. Режим питания светодиода типа LXHL-G1S: напряжение 3В, сила тока 0,3 А

В момент выключения ультразвука включалась CCD и в течение 1,5 минут снималось видео оседания агглютинатов. Типичные фото кадры для положительной и отрицательной реакций агглютинации эритроцитов представлены на рис.2.

Луч, прошедший исследуемый раствор, поступал на полихромную веб-камеру Logitect-Quick Cam, подключённую к ПК. Полученные видео изображения соответствовали процессу седиментации эритроцитов и/или их иммунных комплексов в течение 1,5 минут. Из полученных видеофайлов выбирались изображения, которые затем раскладывались на три цветовых канала RGB. В G (зеленом) канале для каждого изображения рассчитывалась средняя яркость пиксела B (brightness) по заданной области (рис. 2). Средняя яркость B являлась мерой, которая отображала процессы, происходящие в биообъекте, при положительной или отрицательной реакций агглютинации для разных условий экспериментов.

2. Оптимизация времени ультразвукового облучения биообъекта.

Оптимизация времени УЗ действия проводилась на примере обратной реакции агглютинации (подобные исследования для прямой реакции проводились в [16]). Образцы крови III(B) группы были центрифугированы (3000 обор/мин, 8 минут), а плазма отобрана для проведения экспериментов. Во всех пробах использовалось одно и то же разведение: к одной части стандартных эритроцитов добавлялось 5 частей исследуемой плазмы и 5 частей физиологического раствора (плазма разводилась вдвое, 1:1). Объем кюветы составлял 1800 мкл, толщина зазора – 3 мм. Отрицательная и положительная реакции наблюдались всегда для одного и того же образца плазмы. Для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартные эритроциты II(A) группы, а для контрольной отрицательной реакции стандартные эритроциты III(B) группы. Сразу после приготовления проба подвергалась воздействию стоячей ультразвуковой волны. Время воздействия варьировалось от 10 секунд до 3 минут. Затем в течение 1,5 минут снималось видео оседания агглютинатов. Обработка результатов проводилась согласно разделу 1.

3. Оптимизация разведения плазмы исследуемой крови (обратный метод)

Эксперименты данного типа требуют довольно большого количества плазмы крови одной группы. Поэтому центрифугированию подвергались по пять образцов крови II(A) и III(B) групп (3000 обор/мин, 8 минут). Затем в каждой пробе крови отобралось по 2 мл плазмы и образцы плазмы одной группы, но разных доноров смешивались для проведения дальнейших экспериментов. Во всех образцах смеси «плазма-стандартные эритроциты-физраствор» объемная доля стандартных эритроцитов оставалась неизменной и составляла 1/11 часть (9,09%). Таким образом, 10 частей приходилось на смесь плазмы и физиологического раствора. Разбавление плазмы физиологическим раствором варьировалось от неразбавленной плазмы до разведения 1:39, когда на 1 часть плазмы приходилось 39 частей физиологического раствора. Объем кюветы составлял 1800 мкл, толщина зазора – 3 мм. В опытах со II(A) группой крови для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартные эритроциты III(B) группы, а для контрольной отрицательной реакции II(A) группы; в опытах с III(B) группой крови – наоборот.

4. Оптимизация разведения раствора стандартных эритроцитов (обратный метод)

Для нахождения оптимальной степени разведения раствора стандартных эритроцитов центрифугировались пять образцов крови III(B) группы (2000 обор/мин, 5 минут). Затем от каждого образца было отобрано по 1,9 мл плазмы для дальнейших экспериментов. Во всех пробах объемная концентрация исследуемой плазмы (C_пл) оставалась неизменной и составляла 18%. Это значение было выбрано в качестве оптимального по результатам экспериментов раздела 3. Количество стандартных эритроцитов изменялось от равного количеству исследуемой плазмы (разведение 1:1) до разведения 1:17, когда на одну часть стандартных эритроцитов приходилось 17 частей исследуемой плазмы. Объем кюветы составлял 2800 мкл, толщина зазора – 5 мм. Для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартные эритроциты II(A) группы, а для контрольной отрицательной реакции III(B) группы. Время ультразвукового действия на трех компонентную смесь «плазма-стандартные эритроциты-физраствор» составляло 1 минуту для всех проб.

5. Оптимизация разведения эритроцитов (прямой метод)

Образец крови III(B) группы был центрифугирован (3000 обор/мин, 8 минут). Разведение эритроцитарной массы физиологическим раствором варьировалось от 1:25 до 1:175. Оптимальное отношение количества сыворотки к количеству эритроцитов (эритроцитарной массы) во всех пробах оставалось неизменным 10:1. Для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартная сыворотка II(A) группы, а для контрольной отрицательной реакции III(B) группы.

Результаты

Нахождение оптимального времени действия ультразвука на исследуемый биообъект для обратного метода регистрации агглютинации эритроцитов осуществлялось по методике раздела 2. Экспериментальные результаты отражены на рис. 4. Из рисунка видно, что оптимальные значения времени действия лежат в интервале от 30 до 60 с. При больших временах разрешение K падает в основном за счет возрастания яркости B_— , что объясняется следующим образом. При больших временах действия эритроциты в узлах стоячей УЗ волны образуют сравнительно прочные агрегаты (агглютинация отсутствует) и при выключении ультразвука эти агрегаты седиментируют, а среда просветляется.

Оптимизация разведения плазмы исследуемой крови (обратный метод) при постоянстве содержания стандартных эритроцитов осуществлялась по методике раздела 3. Экспериментальные результаты иллюстрируются рис. 4.

Обсуждение

Из рис. 4 легко видеть, что оптимальное значение концентрации исследуемой плазмы варьируется в диапазоне 10÷50 (%). Полученный результат можно трактовать следующим образом. При сильном разведении исследуемой плазмы (концентрация плазмы ниже 10%) содержание агглютининов не достаточно для склеивания (агглютинации) максимально возможного числа стандартных эритроцитов. В то же время при чрезмерных разведениях исследуемой плазмы (концентрация более 50%) агглютининов оказывается не достаточно для агглютинации большей части стандартных эритроцитов. Вышеуказанные пределы разведения плазмы (концентрация плазмы 10÷50(%)) являются оптимальными.

Эксперименты по нахождению оптимального разведения раствора стандартных эритроцитов при постоянстве степени разведения исследуемой плазмы (обратный метод) осуществлялся по методике раздела 4. Результаты показаны на рис.5. Степень разведения исследуемой плазмы составляла 18%, что соответствует максимуму величины K на рис. 4.

Из рис.5 видно, что оптимальными степенями разведения стандартных эритроцитов являются величины в пределах 5÷15 (%). Полагаем, что трактовка результатов рис.5 может быть подобной трактовке результатов, изображенных на рис.4.

Для прямого метода регистрации агглютинации нахождение оптимальных разведений исследуемых эритроцитов проводилось по методике раздела 5. Результаты демонстрирует рис. 6. Соотношение компонент «сыворотка-эритроциты» составляла 10:1.

Рис.6 показывает, что оптимальное разведение исследуемых эритроцитов эритроцитарной массы составляет 1÷2 (%), что близко к результатам, например [11,12,17].

Сводная таблица 2 демонстрирует оптимальные режимы акусто-оптического метода регистрации агглютинации эритроцитов перекрестным методом.

Заключение

Эксперименты позволяют сделать следующие выводы.

1) Найдены оптимальные условия для обеих компонент перекрестного метода типирования крови. При этом оптимальные условия для прямого метода анализа не всегда совпадают с подобными условиями для обратного.

2) Анализ и сопоставление прямого и обратного подходов кросс-метода типирования крови является дальнейшим этапом в разработке акусто-оптического метода определения группы крови.

Результаты исследования могут быть использованы при разработке прибора для инструментального определения групповой принадлежности крови человека.

Литература

1. Vyas G.N. et al. (San Francisco, CA), Simultaneous human ABO and RH(D) blood typing or antibody screening by flow cytometry, United States Patent 5,776,711 July 7, 1998.

2. Sturgeon P. Immunohematology, 17, 4 (2001)

3. Kline T.R., Runyon M.K., Pothiawala M., Ismagilov R.F. Anal Chem., 80(16) 6190-7 (2008)

4. Muranyi I. et al. (Budapest, HU), Blood typing apparatus,United States Patent 4533638, US Patent Issued on August 6, 1985

5. Steven R.A. A Simplified Visible/Near-Infrared Spectrophotometric Approach to Blood Typing for Automated Transfusion Safety, a thesis presented to North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, (2005).

6. Lambert J.B. A miniaturized device for blood typing using a simplified spectrophotometric approach, a thesis submitted to North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, (2006).

7. Moncharmont P., Plantier A., Chirat V., Rigal D. Immunohematology, 19(2), 54-6 (2003).

8. Goldfinger Dennis, et al. (Encino, CA), Portable blood typing apparatus and method. United States Patent 4650662, US Patent Issued on March 17, 1987

9. Battrell, C.F. et al., Microfluidic apparatus and methods for performing blood typing and crossmatching. United States Patent, Patent application number: 20100112723, Publication date: 05/06/2010

10. Алипов А.Н., Ванинский В.З., Денисов Л.Б., Донсков С.И., Дубровский В.А., Завьялов Э.Н., Князьков Н.Н. Способ определения реакции агглютинации Авторское свидетельство изобретения. №1683760, приоритет от 04.06.1987, опубликовано Бюл. №38 от 30.10.1991.

11. Doubrovski V.A., Dvoretski K.N. Ultrasound in Medicine & Biology., 26(4), 655 (2000).

12. Дубровский В.А., Дворецкий К.Н., Балаев А.Э. Акустический журнал, 50(2), 184 (2004).

13. Yu. A. Ganilova, V.A. Doubrovski, I. V. Zabenkov, The resolving power of the flowing method to register the process of human erythrocytes agglutination in vitro on the base of correlation analysis of microphotographs. // Proc.SPIE. 2011 V7999. 799903

14. Дубровский В.А., Ганилова Ю.А., Забенков И.В., Применение спектрально фильтрованного зондирующего светового луча и RGB разложения микрофотографий для проточной регистрации агглютинации эритроцитов, усиленной ультразвуком, Оптика и спектроскопия, 2012, принята в печать.

15. Дубровский В. А. , Долмашкин А. А. , Опт. и спектр., 109(2), 1346-50 (2010).

16. Дубровский В.А., Долмашкин А.А., Определение группы крови на основе цифровых фотографий эритроцитов и их агглютинатов, Медицинская техника, 2012, №2, стр. 24-30.

17. Долмашкин А.А., Дубровский В.А., Забенков И.В., Определение группы крови на основе регистрации упругого рассеяния лазерного излучения методом цифровой фотографии, Квантовая электроника, 2012, 42, №5, 409-417.