Симптомы осмотической резистентности эритроцитов и метод определения показателей

3. Методика определения осмотической резистентности эритроцитов и диаметра эритроцитов. Определение скорости оседания эритроцитов (соэ). Диагностическое значение.

Резистентность – свойство эритроцитов противостоять разрушительным воздействиям: тепловым, осмотическим, механическим и др. В клинике наибольшее значение приобрело определение осмотической резистентности.

Принцип метода состоит в том, что эритроциты в гипертонических солевых растворах сморщиваются, а в гипотонических – набухают. При значительном набухании наступает гемолиз.

В пробирках готовят растворы хлорида натрия различной концентрации (от 0.70 до 0.22%), затем вносят в них один и тот же объем крови (0.02 мл) и оставляют на час при комнатной температуре. Через час пробирки центрифугируют и определяют начало гемолиза по легкому порозовению раствора и полный гемолиз – по интенсивной красно-лаковой окраске раствора.

В норме минимальная резистентность у взрослых людей колеблется между 0,48% и 0,46% хлорида натрия, максимальная – между 0,34% и 0,32% хлорида натрия.

Снижение осмотической резистентности эритроцитов наблюдается при наследственном микросфероцитозе (болезнь Минковского-Шоффара), аутоиммунных гемолитических анемиях. Повышение осмотической резистентности эритроцитов встречается при наследственных гемолитических анемиях, связанных с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, при некоторых гемоглобинопатиях (талассемия).

Измерение диаметра эритроцитов и графическую регистрацию распределения эритроцитов по величине (эритроцитометрическая кривая Прайс-Джонса) производят с помощью прямых микроскопических и электронно-автоматических методов.

Прямой микроскопический метод – это измерение диаметра эритроцитов в фиксированном и окрашенном мазке крови с использованием окуляр – микрометра и объектив-микрометра. Измеряют диаметр 200-500 различных эритроцитов, результаты распределяют по группам в зависимости от величины диаметра и устанавливают в процентах (%) относительную численность каждой группы.

Нормы: содержание нормоцитов (диаметр 6.9-8.0 мкм) составляет приблизительно 68%, микроцитов (диаметр менее 6.9 мкм) – 15%, макроцитов (диаметр более 8.0 мкм) – 17%.

Прямой микроскопический метод чрезвычайно трудоемок, отнимает много времени и поэтому уступает электронно-автоматическому методу.

Электронно-автоматический метод – это подсчет эритроцитов различного диаметра с помощью счетчиков «Культер» и «Целлоскоп».

Эритроцитометрическая кривая Прайс-Джонса в норме имеет правильную форму с вершиной на 7.2 мкм и довольно узким основанием в пределах 6-9 мкм.

Увеличение диаметра эритроцитов (макроцитоз) со сдвигом кривой Прайс – Джонса вправо наблюдается при мегалоцитарных анемиях (витамин-В₁₂-фолиеводефицитные), при заболеваниях печени, при алкоголизме.

Уменьшение диаметра эритроцитов (микроцитоз) со сдвигом эритроцитометрической кривой влево встречается при наследственном микросфероцитозе, железодефицитной анемии, интоксикации свинцом.

Нормальные эритроциты имеют форму диска с вдавлением в центре. В патологических случаях могут появлять­ся эритроциты с измененной формой. Изменение формы эритроцитов называется пойкилоцитозом. Встречаются следующие формы эритроцитов.

Сфероциты – эритроциты, имеющие округлый или ша­рообразный вид, утратившие двояковогнутую форму. Микросфероциты имеют иногда обычные размеры. Сфероцитоз бывает наследственным и приобретенным. Наблю­дается при наследственном микросфероцитозе (болезнь Минковского-Шоффара), гемолитических анемиях, сеп­сисе, искусственных клапанах сердца.

Овалоциты (эллиптоциты) – эритроциты овальной фор­мы. Встречаются при талассемии, наследственном овалоцитозе, тяжелых железодефицитных анемиях, анемиях при лейкозах.

Мишеневидные эритроциты (таргентные клетки, лептоциты) – плоские, бледные, с центральным скоплением гемоглобина в виде мишеней. Бывают при талассемии, тя­желых железодефицитных анемиях, после спленэктомии, при различных видах желтух, алкоголизме. Стоматоциты — центральное просветление у таких эритроцитов изогнуто, напоминает форму рта. Встречают­ся при наследственных стоматоцитозах (относятся к гемо­литическим анемиям), после переливания крови, при опу­холях и циррозе печени, остром алкогольном отравлении.

Акантоциты – эритроциты зазубренной формы, имею­щие выпячивания различной величины. Обнаруживают­ся при наследственных акантоцитозах, тяжелых заболе­ваниях печени (токсических гепатитах, циррозах), гипо­тиреозе, терапии гепарином, хроническом алкоголизме, после спленэктомии.

Эхиноциты – эритроциты с несколькими выростами, как бы покрытые шипами, колючками. Такие формы наб­людаются при тромбоцитопенической пурпуре, раке же­лудка, уремии. Если в мазке все эритроциты имеют такую форму, это говорит о неправильной фиксации мазка.

Каплевидные эритроциты имеют форму капель. Встре­чаются при миелофиброзе и токсических гепатитах.

Анулоциты – эритроциты в виде пустых колец. Наблю­даются в периферической крови при тяжелых формах железодефицитных анемий.

Серповидные эритроциты (дрепаноциты) имеют форму серпов, полулуний, овсяных зерен. Образуются в крови при серповидно-клеточной анемии.

В отличии от анизоцитоза, пойкилоцитоз является бо­лее поздним признаком анемии и отмечается при более тя­желом течении.

В норме зрелые эритроциты периферической крови не содержат никаких включений. И только в ретикулоцитах при суправитальной окраске красителем бриллиант-крезил-блау выявляется зернистосетчатая субстанция.

При различных патологических состояниях в перифе­рической крови обнаруживаются эритроциты с различны­ми включениями: базофильная пунктация — мелкая, си­него цвета, равномерно расположенная в цитоплазме зер­нистость, встречается при отравлении свинцом, ртутью и нередко при некоторых анемиях (мегалобластные, талассемия и др.); крапчатость Шуффнера – мелкая красного цвета зернистость, отмечается при трехдневной малярии; пятнистость Маурера – небольшие сиреневого или красно­го цвета пятнышки, встречаются при тропической маля­рии; тельца Гейнтца-Эрлиха – круглые резко очерченные включения по периферии эритроцита, появляются при отравлении гемолитическими ядами типа нитробензола, анилина, фенилгидразина, при лучевой болезни; тельца Жолли – круглые, сине-фиолетового цвета образования; кольца Кебота – нежные петельки красного цвета. Они имеют вид колечка, восьмерки или скрипичного ключа. Тельца Жолли представляют собой остатки ядерной суб­станции нормобластов, а кольца Кебота – остатки ядерной оболочки и встречаются главным образом при витамин-В₁₂– и фолиеводефицитной анемии, тяжелых отравлениях гемолити­ческими ядами.

Помимо телец Жолли и колец Кебота при витамин-В_12- и фолиеводефицитной анемии в периферической крови можно увидеть клеточные элементы мегалобластического типа кроветворения, который в норме отмечается только в эмб­риональном периоде.

При мегалобластическом кроветворении в кроветвор­ной ткани вместо эритробластов образуются мегалоблас­ты, которые способны к ранней гемоглобинизации при сохранившейся еще структуре ядра. По сродству к щелоч­ным или кислым красителям они подразделяются на базофильные, оксифильные и полихроматофильные. Большая их часть распадается в костном мозге, а меньшая – созре­вает до мегалоцитов, которые и поступают в перифериче­скую кровь. При резком обострении заболевания в пери­ферическую кровь попадают не только мегалоциты, но и мегалобласты. Мегалобласт представляет собой крупную клетку (диаметром более 15 мкм) с эксцентрично располо­женным круглым или овальным ядром. Мегалоциты – это безъядерные клетки размером от 12 до 15 мкм, значитель­но насыщенные гемоглобином. Поэтому цветной показа­тель, как правило, при В₁₂– и фолиево-дефицитной ане­мии больше 1,0 (эту разновидность анемии относят к гиперхромным).

Оседание эритроцитов – это свойство клеток крови осаждаться (седементировать) за пределами кровеносного русла (на дне сосуда при сохранении крови в несвертывающемся состоянии), оставляя сверху слой плазмы. Этот феномен лежит в основе определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ), которая выражается в миллиметрах плазмы, отстаивающейся в течение часа.

Наиболее распространен микрометод определения СОЭ в модификации Панченкова.

Принцип метода: при стоянии крови, стабилизиро­ванной цитратом натрия, эритроциты оседают с различ­ной скоростью в зависимости от физико-химических свойств крови. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) вы­ражается в мм/ч.

Оборудование и реактивы:

аппарат Панченкова, состоящий из штатива с капил­лярами шириной 1 мм, на стенке которых нанесены деле­ния от 0 (сверху) до 100 (снизу). На уровне 0 мм имеется бук­ва К (кровь), а на середине капилляра, около метки 50 мм – буква Р (реактив);

агглютационные (видалевские пробирки);

5% свежеприготовленный раствор натрия цитрата;

Ход исследования. В капилляр Панченкова набирают 5% раствор натрия цитрата до метки «Р» – 50 мм и выду­вают его в видалевскую пробирку. Затем этим же капил­ляром, держа его горизонтально, из уколотого пальца на­бирают два раза кровь до метки «К» – 0 мм и выпускают ее в пробирку с натрия цитратом. Хорошо перемешивают. Этим же капилляром набирают цитратную кровь до мет­ки «К» и ставят строго вертикально в штатив. Получен­ное соотношение объемов крови и натрия цитрата равно 1:4. Через 1 ч отмечают по делениям на капилляре число миллиметров освободившегося от эритроцитов столбика плазмы.

Интерпретация полученных данных. Нормальные показатели СОЭ:

у мужчин – СОЭ 1-10 мм/ч;

у женщин – СОЭ 2-15 мм/ч

Дети имеют более низкую СОЭ (1-8 мм/ч), чем взрослые, а лица среднего возраста меньше, чем старики.

Изменение СОЭ при патологии.

Значительное увеличение – опухолевые заболевания, диффузные болезни соединительной ткани, тяжелые инфекции, болезни почек, протекающие с нефротическим синдромом, выраженная витамин-В₁₂-фолиеводефицитная анемия.

Умеренное увеличение – острые и хронические инфекционные заболевания, локализированные гнойные процессы, инфаркт миокарда, гипертиреоз, тяжелый сахарный диабет, внутренние кровотечения, интоксикации ртутью и мышьяком.

Снижение – эритремия, вторичные симптоматические эритроцитозы, ацидоз, тяжелая сердечная недостаточность.

Симптомы осмотической резистентности эритроцитов и метод определения показателей

Для оценки физико-химических свойств эритроцитов исследуют стойкость (резистентность) эритроцитов к различным воздействиям. Наибольшее распространение в клинической практике получило исследование осмотической резистентности эритроцитов.

Унифицированный метод определения осмотической резистентности эритроцитов
в модификации Л. И. Идельсона (1974).

Принцип

Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в забуферных гипотонических растворах хлорида натрия.

Реактивы

Основной раствор (по своей осмотической концентрации соответствует 10 % раствору хлорида натрия) имеет рН 7,4, состав раствора: двузамещенный фосфат натрия (Na₂HPО₄)—27,31 г (или Na₂HPО₄*2H₂O— 34,23, г), однозамещенный фосфат натрия (NaH₂PО₄*2H₂О)—4,86 г, хлорид натрия— 180 г, дистиллированная вода — до 2 л. Раствор можно хранить в закрытой посуде в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Основной раствор разводят в 10 раз и получают раствор, соответствующий по своей осмотической концентрации 1 % раствору хлорида натрия. Из этого раствора готовят рабочие растворы хлорида натрия следующих концентраций: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20; 0,10%. Можно приготовить по 100 мл этих рабочих растворов и сохранять их в холодильнике. Годны в течение 2 нед.

Специальное оборудование

1. Фотоэлектроколориметр.
2. Термостат на 37 °С.

Ход определения

В две стерильные пробирки с предварительно внесенными 2 каплями гепарина берут по 1,5 мл крови, перемешивают и одну используют для исследования, вторую — оставляют на сутки в термостате. В ряд центрифужных пробирок (14 штук) разливают по 5 мл рабочих растворов хлорида натрия концентрации от 1 до 0,10 %. В каждую центрифужную пробирку добавляют по 0,02 мл перемешанной гепаринизированной крови и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Центрифугируют смесь крови с растворами хлорида натрия при 2000 об/мин в течение 5 мин. Из каждой пробирки сливают надосадочную жидкость и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы.

Холостая проба — надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1 % раствор хлорида натрия.

Расчет

За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100 %, по формуле:

Процент гемолиза=Е_х*100 / Е_1, где
Е₁ — экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия;
Е_Х — экстинкция исследуемой пробы;
100 — процент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хлорида натрия.

На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37 °С.

Нормальные величины

У здоровых в свежей крови начало гемолиза отмечают при концентрации хлорида натрия 0,50—0,45 %, а полный гемолиз — при 0,40—0,35 % растворе хлорида натрия.

Клиническое значение

Исследование проводят при подозрении на гемолитическую анемию. Понижение осмотической резистентности, т. е. появление гемолиза эритроцитов при более высокой, чем в норме, концентрации хлорида натрия (0,70—0,75%), наблюдается при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных гемолитических анемиях, а также иногда при аутоиммунной гемолитической анемии. В ряде случаев понижение осмотической резистентности выявляется только при исследовании инкубированной крови. Повышение осмотической резистентности характерно для талассемии, гемоглобинопатий.

Литература.

Идельсон Л. И. В кн.:Справочник по функциональной диагностике / Под ред. И. А. Кассирского.— М., Медицина, 1970, с. 401.

Осмотическая стойкость эритроцитов

Биоматериал : Кровь ЭДТА

Срок выполнения (в лаборатории) : 8 р.д.

* На сайте указан максимально возможный срок выполнения исследования. Он отражает время выполнения исследования в лаборатории и не включает время на доставку биоматериала до лаборатории. Приведенная информация носит справочный характер и не является публичной офертой. Для получения актуальной информации обратитесь в медицинский центр Исполнителя или call-центр.

Описание

Под осмотической резистентностью эритроцитов понимается их устойчивость по отношению к гипотоническим растворам натрия хлорида. Минимальная резистентность эритроцитов определяется максимальной концентрацией гипотонического раствора натрия хлорида (в серии растворов с постепенно уменьшающейся концентрацией), при которой начинается гемолиз наименее устойчивых эритроцитов, находящихся в растворе в течение 3 ч; максимальная — минимальной концентрацией гипотонического раствора натрия хлорида, вызывающего в течение 3 ч гемолиз всех эритроцитов крови, помещенных в этот раствор. Под минимальной осмотической резистентностью эритроцитов понимают максимальную концентрацию гипотонического раствора натрия хлорида, при которой начинается гемолиз наименее устойчивых эритроцитов, которые находятся в растворе 3 часа. Под максимальной осмотической резистентостью эритроцитов понимают минимальную концентрацию гипотонического раствора хлорида натрия, вызывающего в течение 3 часов гемолиз всех эритроцитов, помещенных в раствор. Максимальная осмотическая резистентность ниже 0,32 % возможна после больших кровопотерь и спленэктомии, при гемоглобинозе С, застойных желтухах, а также в некоторых случаях полицитемии. Повышение осмотической резистентности эритроцитов ниже 0,32 % характерно для талассемии и гемоглобинопатии. Минимальная осмотическая резистентность выше 0,48 % наблюдается при семейной гемолитической анемии, гемолитической анемии новорожденных и отравлении свинцом. Можно обнаружить небольшие изменения и при токсикозах, бронхопневмониях, туберкулезе, малярии, лейкемии, миелосклерозах, лимфогранулематозе, циррозе печени. Случаи расширения границ осмотической резистентности (одновременное понижение минимальной и повышение максимальной Сниженная осмотическая стойкость эритроцитов в гипотонических растворах свидетельствует об структурных дефектах мембраны эритроцита, обусловленных генами мембранных белков. В отличии от сфероцитоза при гемоглобинопатиях (талласемии и S-гемоглобинопатии) возникает относительный избыток мембраны, что ведет к увеличению осмотической стойкости клеток для гипотонического лизиса, поэтому тест позволяет проводить дифф.диагноз между наиболее частыми причинами наследственных гемолитических анемий.

Показания к назначению

Поводом для обследования будет соответствующая клиническая картина. Специфических симптомов, которые будут характерны только отклонению от нормы резистентности нет. Может присутствовать симптоматика такого характера: бледность кожных покровов; снижение веса без видимой причины;повышенная утомляемость и нарастающая слабость, что будет больше похоже на синдром хронической усталости; плохой аппетит; сонливость; обострение хронических заболеваний. При наличии клинической картины нужно обращаться к врачу. Первоначально это врач общей практики, то есть терапевт. Далее обследованием занимаются гематолог и смежные специалисты. Если диагностически будет установлено, что показатели ниже или выше допустимых, в обязательном порядке нужно проходить лечение, так как большая часть этиологических факторов представляет опасность не только для здоровья, но и для жизни пациента.

Интерпретация результатов/Информация для специалистов

Единицы измерения – %. Референсные значения: Осмотический лизис эритроцитов при концентрации NaCl 0,5 г/дл 3-53%, осмотический лизис эритроцитов при концентрации NaCl 0,6 г/дл (после инкубации при +37 ºC) 14-74% , осмотический лизис эритроцитов при концентрации NaCl 0,65 г/дл (после инкубации при +37 ºC) 4-40% , осмотический лизис эритроцитов при концентрации NaCl 0,75 г/дл (после инкубации при +37 ºC) 1-11%. Причины максимальной осмотической резистентности эритроцитов ниже 0,32%: массивные кровопотери; спленэктомия; гемоглобиноз С; застойная желтуха; некоторые случаи полицитемии; талассемия; гемоглобинопатия. Причины минимальной осмотической резистентности эритроцитов выше 0,48%: семейная гемолитическая анемия; гемолитическая анемия новорожденных; отравление свинцом. Расширение границ осмотической резистентности эритроцитов наблюдается в начале острого гемолитического криза, в остром периоде пернициозной анемии.

Определение осмотической резистентности эритроцитов методом проточной цитометрии у пациентов с наследственным сфероцитозом

Полный текст:

• Аннотация
• Об авторах
• Список литературы
• Cited By

Аннотация

Для диагностики наследственного сфероцитоза используется тест осмотической резистентности, оценивающий выраженность гемолиза в серии гипотонических растворов хлорида натрия, который требует больших временных и трудозатрат и обладает невысокой чувствительностью и специфичностью. Предложены новые методики оценки осмотической резистентности при помощи проточной цитометрии, но они недостаточно стандартизованы. Цель исследования – разработка и апробация метода определения осмотической резистентности эритроцитов с помощью проточной цитометрии у пациентов с наследственным сфероцитозом. Материал и методы. Проводилось обследование 33 пациентов с наследственным сфероцитозом и 30 детей контрольной группы. Метод включал исследование препаратов крови в фосфатно-солевом буфере и их серийных разведений в дистиллированной воде при помощи проточной цитометрии – как в свежей крови, так и после 24-часовой инкубации. Оценивалась доля сохранных (не гемолизированных) эритроцитов. В качестве референтных интервалов использованы 5-й и 95-й процентили показателей контрольной группы. Результаты и их обсуждение. Среди лиц с наследственным сфероцитозом до инкубации патологические изменения хотя бы в двух разведениях были выявлены у 81,8 % пациентов, после инкубации патологические изменения обнаружены еще у 4 из 6 пациентов. Диагностическая чувствительность теста 93,9 %, диагностическая специфичность 83,3 %, прогностическая ценность положительного результата (PPV) 86,1 %, прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) 92,6 %. Таким образом, предложенный метод с установлением референтных значений позволяет быстро и объективно оценить осмотическую резистентность эритроцитов и может применяться для дифференциальной диагностики при наследственном сфероцитозе.

Ключевые слова

Об авторах

Людмила Ивановна Волкова, к.м.н.

220013, г. Минск, ул. Петруся Бровки, 3, корп. 3

Список литературы

1. Максимов А.Г., Тыренко В.В., Голота А.С., Живописцева А.М., Малахова С.Н., Петрова Т.Н., Зайцева Т.С. Современные представления о наследственном микросфероцитозе. Вестн. гематологии. 2009; 5 (3): 36–44. @@ Maximov A.G., Tyrenko V.V., Golota A.S., Zhivopistseva A.M., Malakhova S.N., Petrova T.N., Zaitseva T.S. The modern conception of hereditary spherocytosis. Vestnik gematologii = Bulletin of Hematology. 2009; 5 (3): 36–44. [In Russian].

2. Haley K. Congenital hemolytic anemia. Med. Clin. North. Am. 2017; 101 (2): 361–374. doi: 10.1016/j.mcna.2016.09.008.

3. Blanc L., Wolfe L.C. General considerations of hemolytic diseases, red cell membrane, and enzyme defects. In: Lanzkowsky’s manual of Pediatric Hematology and Oncology. 6th ed. Academic Press, 2016: 137–146.

4. King M.J., Garçon L., Hoyer J.D., Iolascon A., Picard V., Stewart G., Bianchi P., Lee S.H., Zanella A., International council for standardization in haemato­logy. ICSH guidelines for the laboratory diagnosis of nonimmune hereditary red cell membrane disorders. Int. J. Lab. Hematol. 2015; 37 (3): 304–325. doi: 10.1111/ijlh.12335

5. Mahajan V., Jain S.K. Hereditary spherocytosis. Neo Reviews. 2016; 17 (12): 697–704. doi: 10.1542/neo.17-12-e697

6. Farias M.G. Advances in laboratory diagnosis of hereditary spherocytosis. Clin. Chem. Lab. Med. 2016; 55 (7): 944–948. doi: 10.1515/cclm-2016-0738

7. Roper D., Layton M. Investigation of the hereditary haemolytic anaemias: membrane and enzyme abnormalities. In: Dacie and Lewis Practical Haemato­logy. 11th ed. Elsevier Ltd, 2011. 245–250.

8. Won D.I., Suh J.S. Flow cytometric detection of erythrocyte osmotic fragility. Cytometry B. Clin. Cytom. 2009; 76B: 135–141. doi: 10.1002/cyto.b.20448

9. Warang P., Gupta M., Kedar P., Ghosh K., Colah R. Flow cytometric osmotic fragility – an effective screening approach for red cell membranopathies. Cytometry B. Clin. Cytom. 2011; 80 (3): 186–190. doi: 10.1002/cyto.b.20583

10. Yamamoto A., Saito N., Yamauchi Y., Takeda M., Ueki S., Itoga M., Kojima K., Kayaba H. Flow cytometric analysis of red blood cell osmotic fragility. J. Lab. Autom. 2014; 19 (5): 483–487. doi: 10.1177/2211068214532254

11. Shim Y.J., Won D.I. Flow cytometric osmotic fragility testing does reflect the clinical severity of hereditary spherocytosis. Cytometry B. Clin. Cytom. 2014; 86B: 436–443. doi: 10.1002/cyto.b.21143

12. Ciepiela O., Adamowicz-Salach A., Zgodziń­ska A., Łazowska M., Kotuła I. Flow cytometric osmotic fragility test: Increased assay sensitivity for clinical application in pediatric hematology. Cytometry. B. Clin. Cytom. 2018; 94 (1): 189–195. doi: 10.1002/cyto.b.21511

13. Manivannan P., Tyagi S., Chandra D., Mish­ra P., Pati H.P., Saxena R. Flow cytometric analysis of patients with hereditary spherocytosis – an Indian scenario. Hematology. 2018; 23 (3): 175–180. doi: 10.1080/10245332.2017.1376855

Для цитирования:

Мицура Е.Ф., Пугачева Ж.Н., Волкова Л.И. Определение осмотической резистентности эритроцитов методом проточной цитометрии у пациентов с наследственным сфероцитозом. Сибирский научный медицинский журнал. 2020;40(3):81-87. https://doi.org/10.15372/SSMJ20200312

For citation:

Mitsura E.F., Pugacheva Z.N., Volkova L.I. Determination of osmotic resistance of erythrocytes using flow cytometry in patients with hereditary spherocytosis. Siberian Scientific Medical Journal. 2020;40(3):81-87. (In Russ.) https://doi.org/10.15372/SSMJ20200312

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Симптомы осмотической резистентности эритроцитов и метод определения показателей

Введение

Проблема адаптации живых организмов к непрерывно изменяющимся условиям окружающей их среды является актуальной среди специалистов медико-биологического профиля. Ключевым звеном в теории адаптации выступает концепция стресса, созданная Г. Селье. По современным представлениям, стресс (у человека) – это типовой патологический процесс, в основе которого лежит сложившаяся в ходе эволюции стандартная неспецифическая генерализованная приспособительная реакция целостного организма на воздействие сверхсильного раздражителя или его угрозу. Процесс адаптации универсален, и, несмотря на многообразие нозологических форм, существуют общие механизмы изменения свойств эритроцитов при стрессе любого происхождения.

В связи с этим для исследования специфики ответной реакции организма на стрессовые воздействия различного генеза нами была изучена кислотная и осмотическая устойчивость эритроцитов при действии токсических веществ (наркотики), естественных факторов (старение) и интенсивной учебной нагрузки.

В исследованиях приняли участие по 10 человек каждой группы, у которых прокалыванием пальца брали кровь. В крови определяли количественные (содержание эритроцитов, гемоглобин, цветовой показатель, СОЭ) и качественные (кислотная и осмотическая устойчивость) показатели. Результаты подвергли статистической обработке методом малой выборки и сравнительному анализу по отношению к контрольной группе.

Сравнение кислотных эритрограмм при старении, стрессе и наркомании проводили по следующим показателям: время продолжительности гемолиза эритроцитов, ширина интервала доминирующей группы эритроцитов в эритроцитарной популяции, время гемолиза максимального количества эритроцитов.

Таблица 1

Показатели кислотной резистентности эритроцитов у больных героиновой наркоманией, при стрессе и старении (M±m, n = 40)

Время начала гемолиза (мин)

P 12 /л, в 0,5 % растворе происходят незначительные изменения. При концентрации NaCl 0,46 % наблюдается резкое снижение количества эритроцитов до 0,114×10 12 /л. По сравнению с физиологической нормой у наркоманов наблюдается снижение количества эритроцитов при концентрации раствора 3 % на 44,8 %, при 0,5 % – на 59,8, при 0,46 % – на 90,6 и при 0,4 % – на 89,7 % (табл. 2).

Таблица 2

Показатели осмотической резистентности при различных состояниях организма

Однако одной из важных причин снижения осмотической и кислотной устойчивости эритроцитов, при действии различных стрессовых факторов следует считать активацию свободно-радикальных процессов. Известно, что сбалансированность процессов окислительно-антиоксидантной системы является непременным атрибутом здорового организма. Вместе с тем активация процессов свободнорадикального окисления лежит в основе многих патологий, в частности, при наркотической зависимости. Известно, что наркотики оказывают влияние на ключевые стадии внутриклеточного метаболизма и, в первую очередь, на процессы энергетического обмена, затрагивающие главным образом аэробное окисление жирных кислот и глюкозы. В результате липофильного действия наркотиков на клеточные структуры изменяются свойства клеточных мембран, их жидко-кристаллическая структура, вязкость и прочность. Это сопровождается угнетением всех функций и преждевременным старением организма.

Учитывая, что одной из общепризнанных гипотез естественного старения организма, стресса и наркотической зависимости является свободнорадикальное окисление биомолекул, можно предположить, что при всех этих процессах имеют место универсальные механизмы, сопровождающиеся активацией свободнорадикального окисления, приводящей к окислительному стрессу и апоптозу.

Количественное содержание эритроцитов крови зависит от многих факторов, общий механизм действия которых выражается в гипоксических состояниях. В качестве таких факторов могут выступать токсические вещества (например, наркотики), нейрогенные факторы (учебная нагрузка) или же естественные изменения, происходящие в организме при старении.

Результаты наших исследований представлены в табл. 3. Из представленных данных видно, что содержание гемоглобина в крови студентов, переживающих состояние стресса, имеет схожие значения и находится в пределах нормы (120-140 г/л). Отличия обнаруживаются при исследовании содержания эритроцитов. Следует подчеркнуть, что в крови студентов их содержание повышено по сравнению с нормой на 21,4 %. Изменения соотношения гемоглобина и эритроцитов в крови студентов привели к повышению цветового показателя (ЦП), отражающего относительное содержание гемоглобина в эритроците.

Таблица 3

Показатели крови при старении, стрессе и наркомании (M±m, n=40)

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/49

Описание патента на изобретение RU2328741C1

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике.

Определение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) является одним из наиболее доступных в лабораторной диагностике методом оценки физико-химических свойств мембран эритроцитов. Изменения ОРЭ наблюдаются при ряде заболеваний, так при гемолитических анемиях (наследственная микросфероцитарная, аутоиммунная) значения этого показателя снижаются, при талассемии, гемоглобинопатиях, механической желтухе – повышаются.

В качестве прототипа авторы предлагают способ определения ОРЭ в модификации Л.И.Идельсона (Медицинские лабораторные технологии. Справочник в 2-х томах / Под редакцией профессора А.И.Карпищенко. – Санкт-Петербург: Интермедика, 2002. – Т.1. – 408 с., ил.). Сущность метода состоит в том, что эритроциты под воздействием растворов с различной концентрацией натрия хлорида способны к разрушению в зависимости от своей осмотической стойкости. Метод основан на количественном определении степени гемолиза в забуференных гипотонических растворах хлорида натрия, в которых, как известно, происходит набухание и гемолиз эритроцитов. Способ заключается в приготовлении основного раствора, который по осмотической концентрации соответствует 10% раствору хлорида натрия с рН 7,4, для чего в 2 литрах дистиллированной воды растворяют 27,31 г натрия фосфата двузамещенного безводного (Na₂HPO₄) или 34,23 г двухводного (Na₂HPO₄·2Н₂O), 4,86 г натрия фосфата однозамещенного двухводного (NaH₂PO₄·2Н₂О) и 180 г натрия хлорида (NaCl). Раствор можно хранить в закрытой посуде в холодильнике в течение нескольких месяцев. Основной раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой, получают раствор, по своей осмотической концентрации соответствующий 1% раствору хлорида натрия. Из этого раствора готовят 14 рабочих растворов, соответствующих растворам хлорида натрия следующих концентраций: 1%, 0,85%, 0,75%, 0,70%, 0,65%, 0,60%, 0,55%, 0,50%, 0,45%, 0,40%, 0,35%, 0,30%, 0,20%, 0,10%. Рекомендуют готовить по 100 мл каждого рабочего раствора, которые при хранении в холодильнике пригодны в течение двух недель. В две стерильные пробирки с 2 каплями гепарина (500 Ед.) вносят по 1,5 мл венозной крови, перемешивают и одну их них используют для исследования, а вторую оставляют на сутки в термостате при 37°С. В 14 центрифужных пробирок помещают по 5,0 мл всех рабочих растворов натрия хлорида от 1% до 0,10%. Затем в каждую пробирку вносят по 0,02 мл гепаринизированной венозной крови и перемешивают. Пробирки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем их центрифугируют в течение 5 минут при 2000 оборотов в минуту. Оптическую плотность надосадочных жидкостей из каждой пробирки измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве холостой пробы используют надосадочную жидкость из пробирки, содержащей 1% раствор натрия хлорида. ОРЭ, выраженную в процентах, определяют путем расчета степени гемолиза в каждой пробирке, приняв за 100% степень гемолиза оптическую плотность супернатанта в пробирке с 0,1% раствором натрия хлорида. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величину экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100%, по формуле

где: E₁ – экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия,

E_x – экстинкция исследуемой пробы,

100 – полный гемолиз в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия.

Аналогичное исследование со второй порцией крови, инкубированной сутки в термостате, выполняют на следующий день.

У здоровых людей в свежей крови гемолиз (минимальная резистентность эритроцитов) начинается при концентрации хлорида натрия 0,50-0,45%, а полный гемолиз (максимальная резистентность эритроцитов) наблюдается в 0,40-0,35% растворе хлорида натрия.

К недостаткам прототипа относятся:

– необходимость использования венозной крови в объеме 3 мл;

– трудоемкость приготовления 14 растворов с различными концентрациями натрия хлорида, что требует существенных затрат времени, большого расхода реактивов и сопряжено с возможными неточностями в навесках солей, измерении объемов растворителя, что может сказаться на точности получения необходимых концентраций растворов;

– использование двукратно 14 рабочих пробирок с кровью требует соответствующего количества лабораторной посуды, количества измерений на фотоэлектроколориметре, что увеличивает время выполнения теста, время дезинфекции, мойки лабораторной посуды, расхода дезинфицирующих средств;

– необходимость повторной постановки теста на следующий день со второй порцией крови, инкубированной сутки в термостате, и использование результатов этого повторного исследования не известно;

– для определения малых концентраций гемоглобина применяемая для фотометрии длина волны 500-560 нм не дает достаточную чувствительность измерения, так как миллимолярный коэффициент экстинкции гемоглобина при этой длине волны ниже, чем при другой длине волны;

– при интерпретации результатов учитываются только концентрации натрия хлорида, вызывающие начало появления гемолиза (минимальная резистентность эритроцитов) и полный гемолиз (максимальная резистентность эритроцитов), тогда как степени гемолиза при всех рабочих концентрациях натрия хлорида рассчитываются, но не учитываются при оценке результатов.

Авторы предлагают способ определения осмотической резистентности эритроцитов капиллярной крови с использованием аптечных растворов – изотонического раствора натрия хлорида (0,9% раствор NaCl), воды для инъекций (дистиллированная вода), которые используются самостоятельно, а также для приготовления 0,45% раствора натрия хлорида.

Техническим результатом предлагаемого способа определения осмотической резистентности эритроцитов капиллярной крови является выявление гемолитических состояний по оценке физико-химических свойств мембран эритроцитов при скрининговых исследованиях.

Авторы предлагают определять ОРЭ капиллярной крови в 0,45% и 0,9% растворах натрия хлорида. Проведение исследования с использованием изотонического 0,9% раствора натрия хлорида, являющегося физиологическим для организма человека, характеризует исходное физико-химическое состояние мембран эритроцитов. Однако определение ОРЭ только с 0,9% раствором натрия хлорида недостаточно для ее полной характеристики. Концентрация 0,45% NaCl выбрана на основании результатов проведенных многочисленных определений ОРЭ с использованием прототипной технологии. Было выявлено, что конфигурация кривых динамики гемолиза различных образцов крови однотипна, и что основные различия наблюдаются при концентрациях 0,4%-0,6% натрия хлорида. Проведение исследования с использованием 0,45% раствора натрия хлорида является осмотической нагрузочной пробой, которая характеризует степень резистентности, то есть резервные возможности, мембран эритроцитов при изменении осмотического давления.

По данным литературы (Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина: этиология, патогенез, спектрофотометрические и биохимические методы исследования, диагностика, лечение. – Л.: Медицина, 1968, – 325 с.) в видимой области спектра поглощения гемоглобина среди трех хорошо заметных полос имеется наиболее интенсивная полоса (Soret) в области 400-430 нм с максимумом поглощения при длине волны 414 нм, при которой миллимолярный коэффициент экстинкции максимальный, что позволяет обеспечить необходимую чувствительность определения экстинкции при измерении малых концентраций гемоглобина, поэтому авторы предлагают использовать для исследования степени гемолиза при определении осмотической резистентности эритроцитов длину волны 414 нм.

Для определения осмотической резистентности эритроцитов используют капиллярную кровь, взятую для клинического анализа крови в пробирку с калиевой солью ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Для исследования используют три центрифужные пробирки. В первую пробирку помещают 2,5 мл дистиллированной воды, во вторую – 2,5 мл изотонического раствора натрия хлорида, в третью – по 1,25 мл дистиллированной воды и изотонического раствора натрия хлорида (для получения 0,45% NaCl).

Ингредиенты 1 пробирка 2 пробирка 3 пробирка Дистиллированная вода 2,5 мл – 1,25 мл Изотонический (0,9%) раствор NaCl – 2,5 мл 1,25 мл Капиллярная кровь 0,01 мл 0,01 мл 0,01 мл

Затем во все пробирки добавляют по 0,01 мл капиллярной крови. Перемешивают и центрифугируют в течение 10 минут при 2000 оборотов в минуту. Измеряют оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб на спекторофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды.

ОРЭ оценивают по степени гемолиза эритроцитов в растворах с разной концентрацией натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в образце с дистиллированной водой, который принимали за 100%, принимая во внимание, что оптическая плотность надосадочных жидкостей образцов имеет прямую зависимость от степени гемолиза.

Степень гемолиза рассчитывали дважды в образцах с 0,9% и 0,45% растворами натрия хлорида по формуле

где Н – степень гемолиза (%),

100 – степень гемолиза в образце с дистиллированной водой,

E_оп. – оптическая плотность надосадочной жидкости в образце,

Е_к. – оптическая плотность надосадочной жидкости в пробирке с дистиллированной водой.

Применив предлагаемый способ определения ОРЭ в группе 70 здоровых людей, определена осмотическая резистентность эритроцитов капиллярной крови, которая составила в исходном, физиологическом для эритроцитов состоянии в 0,9% растворе натрия хлорида – 1,61±0,23%, а при осмотической нагрузочной пробе в 0,45% растворе натрия хлорида – 25,16±1,83%.

Авторы исследовали с помощью клинического анализа капиллярную кровь 122 человек с клиническими признаками анемии для подтверждения диагноза заболевания. Для уточнения генеза заболевания для всех образцов было проведено определение ОРЭ. У 5 человек были выявлены отклонения ОРЭ, которые составили 10,13±1,57% в 0,9% растворе натрия хлорида и 93,58±3,08% в 0,45% растворе натрия хлорида, что послужило основанием для установления наличия гемолитического состояния, назначения дополнительных подтверждающих исследований и адекватной терапии.

Очевидными преимуществами предлагаемого авторами способа определения осмотической резистентности эритроцитов являются:

– использование 30 мкл капиллярной крови, что позволяет использовать пробу крови, полученную для клинического анализа без дополнительного взятия крови;

– способ технически прост и позволяет соблюсти точность концентраций натрия хлорида, так как готовят только один раствор 0,45% натрия хлорида, используя аптечные растворы изотонического раствора натрия хлорида и дистиллированную воду;

– применение способа при скрининговых исследованиях для выявления гемолитических состояний;

– способ экономически выгоден, так как позволяет сократить рабочее время персонала на приготовление растворов, измерение оптических плотностей, мойку лабораторной посуды, количество дезинфицирующих средств.

Похожие патенты RU2328741C1

Реферат патента 2008 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ включает исследование крови и количественное определение степени гемолиза в растворах натрия хлорида различной концентрации, при этом измеряют оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб капиллярной крови: с дистиллированной водой, с 0,9% раствором натрия хлорида и с 0,45% раствором натрия хлорида на спектрофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды, оценивают степень гемолиза при исходном физиологическом физико-химическом состоянии мембран эритроцитов в 0,9% растворе натрия хлорида и при осмотической нагрузочной пробе в 0,45% растворе натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в пробе с дистиллированной водой, которую принимают за 100%, и при значении степеней гемолиза 1,61±0,23% в 0,9% растворе натрия хлорида и 25,16±1,83% в 0,45% растворе натрия хлорида осмотическую резистентность эритроцитов интерпретируют как нормальную. Изобретение обеспечивает выявление гемолитических состояний при скрининговых исследованиях. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 328 741 C1

Способ определения осмотической резистентности эритроцитов, включающий исследование крови и количественное определение степени гемолиза в растворах натрия хлорида различной концентрации, отличающийся тем, что измеряют оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб капиллярной крови: с дистиллированной водой, с 0,9%-ным раствором натрия хлорида и с 0,45%-ным раствором натрия хлорида на спектрофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды, оценивают степень гемолиза при исходном физиологическом физико-химическом состоянии мембран эритроцитов в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и при осмотической нагрузочной пробе в 0,45%-ном растворе натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в пробе с дистиллированной водой, которую принимают за 100%, и при значении степеней гемолиза 1,61±0,23% в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и 25,16±1,83% в 0,45%-ном растворе натрия хлорида осмотическую резистентность эритроцитов интерпретируют как нормальную.

Оценка тяжести кровопотери в хирургической практике. Часть II

Клиническая оценка тяжести кровопотери является исторически самым ранним способом определения нарушений постгеморрагических нарушений гомеостаза, но в настоящее время – самым распространенным способом. Описание основополагающих клинических признаков травматического повреждения с острой кровопотерей мы находим уже в дневниках Н. И. Пирогова, относящихся к периоду Крымской кампании 1854 года: «Лежит такой окоченелый на перевязочном пункте неподвижно; он не кричит, не вопит, не жалуется, не принимает ни в чем участия и ничего не требует; тело его холодно, лицо бледно, как у трупа; взгляд неподвижен и обращен вдаль; пульс как нитка, едва заметен под пальцем и с частыми перемежками. На вопросы окоченелый или вовсе не отвечает, или только про себя, чуть слышным шепотом; дыхание тоже едва приметно. ». Клиническая характеристика кровопотери, основанная на оценке уровня сознания, окраски и температуры кожных покровов, тонуса периферических вен, частоты пульса и дыхания, актуальна и в настоящее время.

Скрининговым методом оценки тяжести кровопотери является предложенный в 1967 году Алговером и Бури шоковый индекс, представляющий собой отношение частоты сердечных сокращений к систоличекому артериальному давлению. Чем выше индекс, тем массивнее кровопотеряе и хуже прогноз. В норме индекс равен 0, 5. Нарастание индекса Альговера свидетельствует о прогрессировании тяжести кровопотери:

Величина

шокового индекса

Ориентировочный

дефицит ОЦК

0, 8

10%

0, 9 – 1, 2

20%

1, 3 – 1, 4

30%

1, 5

40%

В связи с этим, все большему числу клиницистов представляются более физиологически обоснованными и клинически значимыми классификации кровопотери, основанные на клинически определяемой степени резистентности к ней организма. Именно уровень компенсации перенесенной кровопотери представляет несомненный практический интерес, ведь все последующие лечебные мероприятия направлены на стабилизацию функций организма, в той или иной степени нарушенных при кровотечении. Несомненно, к тому же, что в экстренной ситуации целесообразной и практически применимой является такая система оценки кровопотери, которая бы на основании минимального количества параметров позволяла адекватно и быстро определять тяжесть кровопотери не только в стационаре, но уже и на догоспитальных этапах медицинской помощи. Так, Н. А. Яицкий и соавт. (2002) разделяют острую кровопотерю на три степени только на основании величин АДсист и ЧСС (табл. 1)

Таблица 1. Изменения АД и ЧСС при различной степени кровопотери (по Н. А. Яицкому с соавт. , 2002).

Степень кровопотери

Лежа на спине

Сидя

АДсист, мм Hg

ЧСС, в мин

АДсист, мм Hg

ЧСС, в мин

Легкая

Средняя

Тяжелая

Являясь отражением состояния макроциркуляции и, весьма ориентировочно, состояния микроциркуляции, измерение АД может служит быстрым методом оценки гемодинамики и проведения простого ее мониторинга.

К сожалению, предложенные классификации острой кровопотери, основанные на анализе только лабораторных данных, оказываются несостоятельными ввиду невозможности применения их в ранние сроки кровотечения. При массивном кровотечении в первые часы показатели гемоглобина, эритроцитов, гематокрита остаются в пределах исходных значений, т. к. не успевает развиться аутогемодилюция. В некоторых работах прямо указывается, что величина гематокрита лишь отражает проводимую инфузионную терапию, но не является показателям наличия и выраженности кровотечения. Лишь спустя 6-24 часа вследствие аутогемодилюции, проведения заместительной инфузионной терапии показатели красной крови снижаются и позволяют рассчитать предварительный объём кровопотери. Уровень эритроцитов, гемоглобина и гематокрита в периферической крови в ранние сроки кровотечения (1-2 сутки) не отражают истинной тяжести возникшей кровопотери, что затрудняет изолированное использование этих гематологических показателей на ранних этапах диагностики (В. Н. Липатов, 1969; Вострецов Ю. А. , 1997).

В современной клинической практике наибольшее распространение получили методы оценки тяжести кровопотери, имеющие в своей основе анализ комплекса клинических и рутинных лабораторных критериев.

В 1982 году Американская коллегия хирургов на основании интегрального анализа десятков тысяч случаев острых кровотечений различной этиологии, предложила дифференцировать кровопотерю на 4 класса кровотечений в зависимости от клинической симптоматики (по P. L. Marino, 1998):

класс I – при этом клинические симптомы отсутствуют или имеется тахикардия в покое, прежде всего в положении стоя; ортостатической тахикардия считается тогда, когда ЧСС увеличивается не менее, чем 20 ударов в 1 минуту, при переходе из горизонтального положения в вертикальное (соответствует потере 15% объема циркулирующей крови или менее) ;

класс II – основным клиническим признаком его является ортостатическая гипотензия или снижение АД не менее, чем на 15 мм. рт. ст при переходе из горизонтального положения в вертикальное, в положении лежа АД нормальное или несколько снижено, диурез сохранен (соответствует потере от 20 до 25% ОЦК) ;

класс III – проявляется гипотензией в положении лежа на спине, олигурией менее 400 мл/сутки (соответствует потере от 30 до 40% ОЦК) ;

класс IV – проявляется коллапсом и нарушением сознания до комы (потеря более 40% ОЦК).

В современной рациональной трансфузиологии основными ориентирами оценки тяжести кровопотери также являются адекватное сознание, достаточный диурез (> 0, 5 мл/кг/час), отсутствие гипервентиляции, показатели гемокоагуляции, динамика центрального венозного, пульсового и среднего динамического давления, изменение артерио-венозной разницы по кислороду (А. П. Зильбер, 1999; В. С. Ярочкин 1997, 2004).

Одной из последних отечественных классификаций острой кровопотери предложена А. И. Воробьевым (2002). Автор подчеркивает, что именно клинические, а не лабораторные показатели должны являться определяющими в оценке тяжести кровопотери (табл. 2).

Таблица 2. Оценка степени тяжести острой массивной кровопотери (по А. И. Воробьеву с соавт. , 2002).

Показатель

Степень тяжести

I

II

III

IV

Пульс, в мин.

АД

Пульсовое давление

Нормальное или повышено

ЧДД, в мин.

Почасовой диурез, мл

Состояние ЦНС

Объем кровопотери, мл

(% ОЦК)

В повседневной клинической практике мы используем классификацию тяжести кровопотери, основанную как на оценке клинических критериев (уровень сознания, признаки периферической дисциркуляции, АД, ЧСС, ЧДД, ортостатическая гипотензия, диурез), так и на оценке основополагающих показателей картины красной крови – величин гемоглобина и гематокрита (В. К. Гостищев, М. А. Евсеев, 2005). Классификация различает четыре степени тяжести острой кровопотери:

I степень (легкая кровопотеря) – характерные клинические симптомы отсутствуют, может иметь место ортостатическая тахикардия, уровень гемоглобина выше 100 г/л, гематокрит – не менее 40%. Отражает величину дефицита ОЦК до 15%.

II степень (кровопотеря средней тяжести) – из клинических симптомов определяется ортостатическая гипотензия со снижением АД более чем на 15 мм рт. ст. и ортостатическая тахикардия с увеличением ЧСС более чем на 20 ударов в минуту, уровень гемоглобина в пределах 80 – 100 г/л, гематокрит – в пределах 30 – 40%. Отражает величину дефицита ОЦК 15 – 25%.

III степень (тяжелая кровопотеря) – клинически определяются признаки периферической дисциркуляции (дистальные отделы конечностей холодные наощупь, выраженная бледность кожи и слизистых), гипотония (АДсист находится в пределах 80 – 100 мм рт. ст. ), тахикардия (ЧСС более 100 в минуту), тахипноэ (ЧДД более 25 в минуту), явления ортостатического коллапса, диурез снижен (менее 20 мл/час), уровень гемоглобина находится в пределах 60 – 80 г/л, гематокрит – в пределах 20 – 30%. Отражает величину дефицита ОЦК 25 – 35%.

IV степень (кровопотеря крайней степени тяжести) – из клинических симптомов характерными являются нарушение сознания, глубокая гипотония (АДсист менее 80 мм рт. ст. ), выраженные тахикардия (ЧСС более 120 в минуту) и тахипноэ (ЧДД более 30 в минуту), признаки периферической дисциркуляции, анурия; уровень гемоглобина находится ниже 60 г/л, гематокрита – 20%. Отражает величину дефицита ОЦК больше 35%.

В основу данной классификации положена оценка наиболее значимых клинических симптомов, отражающих реакцию организма на кровопотерю. Определение уровня гемоглобина и гематокрита представляется также весьма важным в оценке тяжести кровопотери, особенно при III и IV степени тяжести, поскольку в данной ситуации гемический компонент постгеморрагической гипоксии становится весьма существенным. Кроме того, уровень гемоглобина по-прежнему является решающим критерием для определения показаний для трансфузии эритроцитарной массы.

Следует заметить, что срок от появления первых симптомов кровотечения и тем более от его действительного начала, составляющий, как правило, не менее суток, делает показатели гемоглобина и гематокрита вполне реальными в силу успевшей развивиться за данный период гемодилюции. В случае несоответствия клинических критериев показателям гемоглобина и гематокрита оценку тяжести кровопотери следует проводить, учитывая показатели, в наибольшей степени отличающиеся от нормальных значений.

Предложенная классификация тяжести кровопотери представляется нам приемлемой и удобной именно для клиники ургентной хирургии, как минимум, по двум причинам. Во-первых, оценка кровопотери не требует проведения сложных специальных исследований. Во-вторых, возможность определения степени кровопотери сразу же в приемном отделении позволяет решить вопрос о необходимости начала инфузионной терапии и госпитализации пациента в отделение интенсивной терапии.

По нашим наблюдениям из 1204 пациентов с ОГДЯК у большей части (35, 1%) пациентов при госпитализации была диагностирована кровопотеря II степени. С кровопотерей III и I степеней были госпитализированы соответственно 31, 2% и 24, 8% пациентов. Доля пациентов с кровопотерей IV степени составила 8, 9%. Доля пациентов с кровопотерей I степени с увеличением возраста пациентов имела тенденцию к снижению с 33, 5% у больных моложе 45 лет до 2, 3% у больных старческого возраста, что может быть объяснено уменьшающейся с возрастом резистентностью организма к кровопотере и возникновением выраженной клинической манифестации при сравнительно меньших темпах геморрагии. Напротив, массивная кровопотеря для больных пожилого и старческого возраста приобретает характер фатальной уже на догоспитальном этапе, о чем свидетельствует снижение доли больных с кровопотерей III и IV степеней в возрастных группах 60 – 74 лет и старше 75 лет.

Среди больных с кровопотерей I и II ст. наибольший удельный вес имели пациенты моложе 45 лет. Доля больных в возрасте 45 – 59 лет, составлявшая при кровопотере I ст. 31, 4%, достигает 40, 3% при кровопотере III ст. Данный возрастной контингент составлял практически половину больных с кровопотерей IV ст. Доля больных 60 – 74 лет достигает максимума при кровопотере II степени и уменьшается при усугублении тяжести кровопотери. Аналогичная картина распределения отмечается и у больных старческого возраста: 15, 9% среди больных со II ст. кровопотери и совсем незначительная среди больных с III (7, 5%) и IV (5, 5%) ст.

Сопоставление этиологической структуры и тяжести кровопотери в различных возрастных группах позволяют сделать следующие выводы. Пациенты 45 – 59 лет, составляя наибольшую долю из больных с кровопотерей III и IV ст. , одновременно имеют наибольший удельный вес в группе каллезных язв (36, 7%) и значительный (30, 8%) в группе хронических язв. Данный факт указывает именно на каллезную язву как на основной этиологический фактор возникновения острой массивной кровопотери при ОГДЯК. Существенная доля (35, 3%) больных в возрасте 60 – 74 лет от группы пациентов с каллезной язвой и существенной (хотя и меньшей по сравнению с предыдущей возрастной группой за счет уменьшения абсолютного числа больных) долей больных с кровопотерей III ст. (20, 4%) и IV ст. (19, 7%) также указывает на то, что каллезный характер язв – важный фактор возникновения массивного кровотечения. Незначительный удельный вес пациентов старше 75 лет среди всех с кровопотерей III и IV ст. (7, 5% и 5, 5%) даже при наличии у 20, 5% пациентов каллезных язв указывает на низкую резистентность больных данной группы к массивной кровопотере и их гибели еще на догоспитальном этапе.

Оценка нарушений системы гемостаза у больных с ОГДЯК. Помимо определения тяжести кровопотери принципиально важной задачей диагностики у пациентов с гастродуоденальными язвенными кровотечениями является количественная и качественная оценка нарушений системы гемостаза, поскольку расстройства гемокоагуляции являются важнейшим патогенетическим звеном синдрома острой массивной кровопотери, а их адекватная и своевременная коррекция – обязательным компонентом заместительной терапии. А. И. Воробьев и соавт. (2001) подчеркивают, что очень часто острая массивная кровопотеря происходит у больных с исходно существующими нарушениями в системе свертывания крови. Наиболее часто эти нарушения проявляются формированием гиперкоагуляционного синдрома, нередко определяющего тяжесть течения синдрома острой массивной кровопотери, трансфузиологическую тактику ее восполнения и предупреждения развития острого ДВС-синдрома.

Гиперкоагуляционный синдром характеризуется определенными клиническими проявлениями и лабораторными признаками повышенной готовности крови к свертыванию при отсутствии тромбозов. Общее состояние при гиперкоагуляционном синдроме чаще удовлетворительное, больные могут отмечать чувство «тяжести в голове» и головную боль, быструю утомляемость, слабость. Кровь при заборе из вены сворачивается прямо в игле, места венепункции легко тромбируются. Несмотря на то, что кровяной сгусток в пробирке формируется быстро, он рыхлый и нестойкий; отмечаются укорочение времени свертывания крови по Ли-Уайту и АЧТВ, повышены агрегационные показатели тромбоцитов, удлинен фибринолиз.

Принято считать, что массивная кровопотеря, сопровождающаяся выраженными нарушениями гемодинамики с расстройствами периферического кровотока, практически всегда сопровождается появлением гиперкоагуляционной фазы ДВС-синдрома. Гиперкоагуляционная фаза ДВС-синдрома часто бывает весьма скоротечной и не диагностируется. Тем не менее, при данной фазе ДВС-синдрома признаки гиперкоагуляции выражены весьма отчетливо: укорочены АЧТВ, протромбиновое время, снижены уровень фибриногена и число тромбоцитов. Скорость образования кровяного сгустка в пробирке по-прежнему ускорено, но он остается рыхлым и нестойким.

Для гипокоагуляционной фазы ДВС-синдрома характерны с одной стороны лабораторные маркеры коагулопатии потребления а с другой – наличием признаков гипокоагуляции и диффузного геморрагического диатеза (кровоточивость гематомно-петехиального типа). Приводим основные лабораторные и клинические признаки гиперкоагуляционного синдрома и фаз ДВС-синдрома (табл. 3).

Таблица 3. Лабораторные и клинические признаки нарушений гемокоагуляции (по А. И. Воробьеву и соавт. , 2001).

Форма нарушения гемокоагуляции

Лабораторные и клинические признаки

Гиперкоагуляционный синдром

Лабораторные признаки: укорочение АЧТВ, протромбинового времени; повышение активности тромбоцитов; снижение активности фибринолиза.

Клинические проявления: тромбирование иглы при венепункции, быстрое формирование рыхлого и нестойкого кровяного сгустка в пробирке.

Гиперкоагуляционная фаза ДВС-синдрома

Лабораторные признаки: укорочение АЧТВ, протромбинового времени; повышение активности тромбоцитов при сниженном их количестве; снижение уровня фибриногена, АТ III, протеина С, активности фибринолиза.

Клинические проявления: быстрое тромбирование иглы при венепункции, появлене признаков полиорганной недостаточности.

Гипокоагуляционная фаза ДВС-синдрома

Лабораторные признаки: удлинение АЧТВ, протромбинового времени, снижение количества и активности тромбоцитов; снижение уровня фибриногена, факторов свертывания, АТ III, протеина С; ускорение фибринолиза; резкое повышение уровня продуктов деградации фибрина, D-димеров.

Клинические проявления: трудноконтролируемая диффузная кровоточивость, развернутая картина полиорганной недостаточности.

Статья добавлена 2 апреля 2016 г.